Sagor

Membran i regleringen av DNA-replikation. reglering av DNA-replikation. Reglering av plasmid ColE1-replikation

En detaljerad övervägande av de molekylära mekanismerna för reglering av DNA-replikation ligger utanför bokens ram, så vi kommer att begränsa oss till några kommentarer i denna fråga och diskutera mer i detalj endast mekanismen för reglering av replikation i E. coli, inklusive bakteriella plasmider, som är direkt relaterad till funktionen hos plasmidvektorer i bakterieceller.

DNA-syntes är nära besläktad med andra processer som förbereder celldelning, eftersom överföringen av den nödvändiga genetiska informationen från förälderceller till dotterceller är avgörande för ättlingceller. Närvaron av överflödig genetisk information påverkar cellers livsduglighet negativt, medan dess brist, till följd av DNA-underreplikation, leder till en dödlig effekt på grund av frånvaron av vitala gener. Processen att överföra genetisk information från förälderceller till dotterceller i eukaryoter är dock inte begränsad till en enkel reduplicering av kromosom-DNA. Så, för insekter av många arter, närvaron av jätte polyeten kromosomer som uppstår som ett resultat av flera omgångar av DNA-replikation av de ursprungliga kromatiderna, som inte åtföljs av deras divergens.

Polytenisering kromosomer representerar en bred klass av genetiska fenomen associerade med selektiv redundant replikation ( animation) eller underreplikation av individuella eukaryota genetiska loci. Ett slående exempel av detta slag är förändringen i antalet ribosomala RNA-gener hos djur. Amplifiering av rRNA-gener i amfibieoocyter sker genom bildandet av deras extrakromosomala (extrakromosomala) kopior i form av cirkulära ribosomala (p)DNA-molekyler, som sedan replikeras av mekanismen "rullande ring". Samtidigt amplifieras endast en av de hundratals rDNA-upprepningarna i varje cell, så att amplifiering av rDNA på en upprepning på något sätt undertrycker amplifieringsprocessen på andra, och alla upprepningar som bildas i en oocyt är identiska, men skiljer sig från uppsättningar av amplifierat rDNA från andra oocyter. Strikt stadie- och vävnadsspecificitet, såväl som selektiv amplifiering av endast en rDNA-upprepning, indikerar närvaron av fina regleringsmekanismer för replikationsprocessen också i detta fall.

Typiska exempel på en ökning av antalet gener på grund av deras selektiva replikation är förstoring rRNA-gener och förändringar i antalet gener som bestämmer cellresistens mot läkemedel. I det första fallet åtföljs förlusten av en del av rRNA-generna i Drosophila som ett resultat av deletion av en gradvis återställande av deras antal, medan i det andra fallet i celler under förhållanden med selektiv verkan av en toxisk läkemedel, ökar antalet kopior av generna som är nödvändiga för dess neutralisering. I synnerhet är detta karakteristiskt för dihydrofolatreduktasgenen i närvaro av metotrexat. Det föreslås att förändringen i antalet kopior av sådana gener är baserad på mekanismen för ojämn korsning.

Replikationen av bakteriella kromosomer är nära förknippad med cellmetabolism. Till exempel beror frekvensen av initiering av nya omgångar av replikering på tillväxthastigheten för bakterieceller, och celler från snabbt växande bakterier kan innehålla kromosomer med flera fungerande replikationsgafflar, även om endast två krävs för replikering av en bakteriell kromosom, initierad i ett enda replikationsursprung (ori) och divergerande i motsatta riktningar. Detta tillåter bakterier, under gynnsamma förhållanden, att spendera mindre tid för generering än för fullständig replikering av bakteriekromosomen. Uppenbarligen måste det finnas subtila mekanismer för att reglera replikering på nivån för initiering av nya omgångar för att upprätthålla en strikt ordnad karaktär av replikering. Sådana mekanismer finns.

För närvarande är de mest väl studerade mekanismerna för reglering av DNA-syntes i E. coli, inklusive mekanismerna för kontroll av antal kopior i den lilla E. coli-plasmiden ColE1, som kommer att diskuteras mer i detalj nedan på grund av betydelsen av dessa fenomen för genetiska teknik.
^

4.2.1 Initiering av DNA-replikation i E. coli och dess reglering

Kromosomal DNA-replikation i bakterier spelar en nyckelroll i deras livscykel. Under denna process duplicerar mikroorganismer sitt genom, och de resulterande dottergenomen passerar sedan in i dotterceller. Den höga noggrannheten med vilken bakterier utför sådana processer indikerar närvaron av speciella mekanismer för deras samordning och kontroll.

^ Struktur för replikeringsstartområdet oriC. E. coli-kromosomen innehåller en singel ursprunget för replikation(ursprung) namnges oriC, där replikering initieras (Fig. I.47, a). Storleken på minimiregionen för replikationsursprunget, som ger autonom replikering av kromosomen, är 258 bp. (position 11-268 i figur I.47). En jämförelse av de primära strukturerna för replikationsursprungsregionerna hos olika enterobakterier visade att deras sekvenser representeras av korta konserverade regioner, som är varvas med divergerande DNA-segment, vars längder dock är mycket konserverade. De konserverade regionerna visade sig vara bindningsställen för regulatoriska proteiner separerade av spacersekvenser. OriC innehåller fem konsensus 9-nukleotiders DnaA-initiatorbindningsställen (icke-palindromiska upprepningar) som kallas DnaA-boxar. I alla Enterobacteriaceae innehåller replikationsursprunget 9–14 GATC-ställen, varav åtta positioner är bevarade.

På vänstra sidan oriC det finns en AT-rik region som innehåller tre liknande sekvenser med 13 nukleotider långa, som var och en börjar med GATC. AT-klustret är också lokaliserat här, som tillsammans med den vänstra 13-nukleotidsekvensen bildar ett område med instabil DNA-helix ( DNA-avrullande element). Denna sektion av DNA kan ersättas utan funktionsförlust med en liknande nukleotidsammansättning, men med en annan nukleotidsekvens.

OriC innehåller bindningsställen för proteiner som böjer DNA, IHF (integrationsvärdfaktor) och FIS (faktor för inversionsstimulering). Båda proteinerna verkar hjälpa DNAA-initiatorn att varva ner DNA.

Dimeriskt protein IciA, bestående av subenheter med molekylvikt 33 kDa, binder specifikt till AT-rika 13-mer upprepningar. Funktionen av detta protein är okänd, liksom funktionen av Rob-proteinet, som specifikt interagerar med 26-bp-stället på höger sida av R4 DnaA-rutan. DNA nära Rob-platsen uppvisar en knäck som är mer uttalad i molekyler som är helt metylerade med Dam-metyltransferas (se nedan). Sådant helt metylerat DNA interagerar med det histonliknande proteinet H-NS, vars bindningsställe överlappar Rob-stället. Denna interaktion påverkar funktionen oriC.

Ris. I.47. Strukturen av replikationsursprungsregionen av E. coli-kromosomen ( a) och schemat för att initiera dess replikering ( b)

HobH är ett protein som interagerar med en enkelsträngad metylerad DNA-region av replikationsursprunget (hemimetylerad ursprungsbindning)
^ Funktioner av DNAA-proteinet. DNAA-protein spelar en nyckelroll vid montering replisomer- ett multikomponentproteinkomplex som utför dubbelriktad DNA-syntes. Proteinet känner igen replikationsursprunget och attraherar de återstående proteinkomponenterna i replisomen till monteringsstället.

^ Stadier av initiering av DNA-syntes på oriC. hopsättning första komplex börjar med interaktionen av DnaA-proteinet med DnaA-rutorna R1–R4 och M (se Fig. I.47, b). För framgångsrik passage av de efterföljande stegen av replisomsammansättningen måste DnaA-proteinet vara i komplex med ATP och interagera med supercoiled oriC. Med hjälp av ett elektronmikroskop detekteras det initiala komplexet som en kompakt ellipsoidstruktur innehållande 20 DnaA-monomerer, som sluter oriC. Det initiala komplexet har en mycket ordnad struktur.

I närvaro av ATP i en hög koncentration (5 mM) omvandlas det initiala komplexet till utomhuskomplex. I detta komplex, partiell avveckling av AT-rika 13-nukleotidupprepningar placerade på vänster sida av oriC. Vid 37° eller högre kan ett enda DNAA-protein ge DNA-avveckling. Bildandet av ett öppet komplex vid lägre temperaturer kräver deltagande av det strukturerande proteinet HU eller integrationsfaktorn av värdbakterien IHF. I det öppna komplexet finns små områden av otvinnat DNA på höger sida oriC mellan DnaA-boxarna R2 och R4, som anses vara helikopterlandningsplatser.

DnaB-proteinet är en helikas av replikationsgaffeln och går in i ett öppet komplex för att bildas prepriming komplex I interagerar med enkelsträngade regioner av delvis otvinnat DNA. Sådana ställen framställs av DnaA-proteinet, som undantränger SSB-proteinet från motsvarande ställen. DnaB går in i prepriming-komplex I som hexamerer komplexbundna med sex DnaC-monomerer, som var och en binder en ATP-molekyl. I detta komplex blockeras helikasaktiviteten hos DnaB-proteinet. Frisättningen av DnaC från komplexet sker som ett resultat av ATP-hydrolys. Konsekvensen av detta är aktiveringen av DnaB-helikasen och dess korrekta placering i komplexet. Kombinationen av dessa händelser omvandlar prepriming-komplex I till prepriming komplex II.

Helicase bör börja fungera i början av replikeringsgaffeln på höger sida oriC nära DNAA-rutorna R2, R3 och R4. För att göra detta måste den translokeras från platsen för dess första inträde i komplexet till ursprungspunkten för replikering. Det antas att translokation är associerad med ATP-beroende frisättning från DnaC-proteinkomplexet, vilket åtföljs av helikasaktivering.

PÅ primerkomplex DnaB-helikas interagerar med DnaG-primas, som spelar en nyckelroll för att säkerställa initiering av replikering exakt på oriC. Båda dessa enzymer säkerställer konjugationen av funktionen hos två replikationsgafflar som rör sig i motsatta riktningar. I ett cellfritt system, vid låga koncentrationer av primas, blir replikationen enkelriktad och kanske inte initieras på oriC. I primingkomplexet krävs inte längre närvaron av DnaA-proteinet, och efter att ha frigjorts från komplexet kan det återanvändas för att initiera replikering på en annan oriC. Man tror att under den koordinerade sammansättningen av två replikationsgafflar syntetiseras en primer i en av dem, som blir en primer under syntesen av den ledande strängen genom att den andra replikationsgaffeln rör sig i motsatt riktning. Primas i primingkomplexet fungerar genom en fördelningsmekanism. Efter primersyntes lämnar den replikationsgaffeln och ersätts av en ny primasmolekyl under bildandet av nästa Okazaki-fragment.

Under bildandet av en replisom i varje replikationsgaffel sker den ATP-beroende bildningen av det dimera komplexet av DNA-polymeras III-holoenzymet associerat med 3'-ändarna av primrarna (glidande klämma, se ovan). Detta följs av en koordinerad förlängning av primrarna, åtföljd av en dubbelriktad syntes av ledande och eftersläpande DNA-kedjor I ett cellfritt system är utgångspunkterna för syntesen av ledande kedjor lokaliserade i oriC nära DNAA-rutorna R2, R3 och R4.

^ Mekanismer för att kontrollera initieringen av replikation in vivo. DNA-replikationsinitiering i E. coli regleras åtminstone på tre nivåer: 1) initiering är synkroniserad med cellcykeln; 2) DNA-syntes i varje region av replikationsursprunget i cellcykeln initieras endast en gång; 3) initiering sker synkront i alla regioner av replikationsursprunget närvarande i en given bakteriecell. Det har fastställts att DNA-syntes börjar efter att massan av en bakteriecell per ett område av replikationsursprunget når ett visst värde, som kallas massinitiering(initieringsmassa). DNAA-proteinet anses för närvarande vara den huvudsakliga pacemakern, som spelar en nyckelroll i kontrollen av replikationsinitiering.

Undertryckande av proteinsyntes in vivo åtföljs av fullbordandet av redan initierad DNA-syntes mot bakgrund av avslutningen av nya omgångar av initiering. Återupptagandet av proteinsyntes leder till initiering av replikation efter en fördröjningsperiod på en cellgenerering. I närvaro av alla nödvändiga proteiner är initiering känslig för rifampin, en specifik hämmare av bakteriellt RNA-polymeras, vilket indikerar initieringens beroende av syntesen av otranslaterat RNA.

Roll av oriC topologi i replikationsinitiering . Topoisomeras I och topoisomeras II (DNA-gyras) bibehåller den bakteriella kromosomen i ett negativt supercoiled tillstånd. Ungefär hälften av supercoilerna neutraliseras av de histonliknande proteinerna HU, IHF och FIS, medan den återstående supercoilingen av bakteriekromosomen underlättar transkription, replikation och platsspecifik rekombination. Det antas att den bakteriella kromosomen består av 40–50 superspolade domäner med 25 superspolar per 1 kb. DNA. För närvarande finns det inga exakta data om det topologiska tillståndet oriC krävs för att initiera replikation i E. coli. Det är känt att mutationer i topoisomerasgenen topA undertrycka temperaturkänsliga mutationer dnaA(Ts). Det antas att i dessa mutantstammar topologin oriC modifierad på ett sådant sätt att den tillåter initiering av replikation vid lägre intracellulära koncentrationer av DnaA-proteinet. Dessutom vikten av ett visst topologiskt tillstånd oriC för initiering indikerar en kränkning av initiering i muterade bakterier med en förändrad gen gyrB(Ts) kodar för B-subenheten av DNA-gyras.

Aktivering av replikering genom transkription. I händelse av att supercoiling av minikromosomer eller plasmider innehållande oriC, är otillräcklig för att initiera deras replikering, kan initiering ske med samtidig transkription av DNA i närheten oriC. Ändra topologin oriC I detta fall kan det utföras genom formationen R-slingor(DNA-RNA-hybrid i dubbelsträngat DNA) eller på grund av transkription som sådan, där lokal positiv supercoiling av DNA sker före det transkriberande RNA-polymeraset, följt av negativ supercoiling. Detta underlättar bildandet av öppna komplex vid initiering av DNA-syntes.

^ Proteins rollDNAAi regleringen av replikeringsinitiering.~60 minuter är nödvändigt för bakterier att replikera kromosomalt DNA, separera dotterkromosomer och förbereda sig för en ny delning. Följaktligen celler med en generationstid kortare än denna period (till exempel vid förhöjda temperaturer vid rik näringsmedia) måste initiera replikeringen av kromosomer avsedda för efterföljande divisioner innan den föregående replikeringsrundan är klar. Således kan en enda cell innehålla en replikerande kromosom med flera replikationsstartpunkter. I detta fall sker initieringen av replikering på flera områden i början av replikeringen samtidigt.

Överproduktion av DnaA i bakterier leder till en kraftig ökning av frekvensen av replikationsinitieringar utan att ändra den totala hastigheten för DNA-syntes, vilket indikerar att DnaA är en positiv regulator av denna process. Bland modellerna som förklarar mekanismen för den reglerande verkan av DnaA-proteinet är DnaA-titreringsmodellen den mest använda. I enlighet med denna modell binds (titreras) hela det nysyntetiserade DnaA-proteinet av DnaA-boxar. oriC kromosomer. Så snart antalet initiatormolekyler överstiger antalet intracellulära DnaA-boxar (alla DnaA-boxar är upptagna av proteinet) initieras DNA-syntes. Efter påbörjad initiering på en oriC det sker en frisättning av DnaA-molekyler, en kraftig ökning av dess intracellulära koncentration och en synkron initiering av DNA-syntes vid andra tillgängliga regioner av replikationsursprunget. Samtidigt, association med membranen av den första oriC skyddar den från att användas vid reinitiering.

Rollen av Dam-metylering i initieringen av DNA-syntes. Som nämnts ovan, modifierar E. coli Dam-metyltransferas adeninrester i 5'-GATC-sekvenser. Som ett resultat av replikation ändras DNA-molekylen tillfälligt från en helt metylerad molekyl till en metylerad molekyl längs en sträng, vilket gör att cellen kan känna igen nya syntetiserat DNA. Placering av dam- platser i oriC Enterobacteriaceae är mycket konservativ (se fig. I.47, a). Ometylerad eller halvmetylerad plasmid-DNA replikerar inte i dammutantceller, även om den fungerar som ett substrat i det cellfria replikationssystemet. Kromosomal DNA-replikation i dammutanter börjar kl oriC, dock är replikeringskontrollen bruten, vilket visar sig i asynkron replikering på multipla oriC. Det visade sig att endast hälften metylerade, men inte helt metylerade eller ometylerade oriC- DNA binder specifikt till en fraktion av E. coli-membran in vitro. Samtidigt, i snabbt växande celler 1/3 av generationstiden oriC- DNA är i ett halvmetylerat tillstånd, varefter det är helt metylerat. Detsamma gäller för promotorn för DnaA-initiatorgenen, i vilken det halvmetylerade tillståndet är associerat med undertryckande av gentranskription. Däremot sker remetylering av den nysyntetiserade DNA-strängen av resten av bakteriekromosomen snabbt, inom 1–2 minuter. Baserat på denna typ av data föreslås det att i det ofullständigt metylerade tillståndet är ovanstående sekvenser skyddade av bakteriella membran från kontakter med regulatoriska proteiner och kan inte delta i den upprepade omgången av replikationsinitiering (period förmörkelse). Mutationer i en gen seqA drastiskt minska förmörkelsetiden, vilket manifesteras i asynkroni av replikationsinitieringar. SeqA-proteinet visade sig vara en negativ regulator av replikationsinitiering, som agerar i interaktionsstadiet oriC med bakteriemembran.

^ SeqA-proteinets roll i regleringen av bakteriell kromosomreplikation. Gen seqA kodar för ett protein med en längd på 181 aminosyrarester, vars inaktivering är dödlig för bakterieceller. Studien av interaktionen av detta protein med ometylerade, partiellt och helt metylerade regioner av replikationsursprunget genom metoden för bandskiftning under elektrofores i polyakrylamidgel visade dess preferensbindning till partiellt metylerade sekvenser. För den fullständiga (kontextberoende) specificiteten av dess interaktion krävs dock närvaron av ytterligare faktorer. Faktum är att i sammansättningen av DNA-proteinkomplex bildade med deltagande av delvis metylerade sekvenser oriC, fann man ett protein med en molekylvikt på 24 kDa som specifikt interagerar med den metylerade DNA-strängen i oriC. Screening av E. coli-sekvensklonbiblioteket gjorde det möjligt att klona genen hobH (hemimetylerad ursprungsbindning) som kodar för detta protein. Mutationer i denna gen ledde till en partiell förlust av synkronisering vid replikationsinitiering av bakterieceller, vilket också indirekt indikerar involveringen av HobH-proteinet i regleringen av bakteriell kromosomreplikationsinitiering i de tidiga stadierna av cellcykeln. Den verkliga rollen för detta protein vid replikering är dock inte helt känd.

Förmörkelseperioden kan sluta som ett resultat av det gradvisa fullbordandet av metyleringen av en delvis metylerad sekvens oriC i samband med membran. Fullständig metylering av dessa sekvenser förhindrar deras interaktion med membran och gör dem tillgängliga för DnaA-initiatorn.

^ replikeringsavslutning. Mötet mellan två replikationsgafflar i slutet av den bakteriella kromosomreplikationscykeln åtföljs av flera händelser som är nödvändiga för fullständig separation av de två resulterande bakteriella kromosomerna före celldelning. Rörelsen av replikationsgafflar mot varandra åtföljs av homolog rekombination mellan dotterkromatider. I händelse av att antalet rekombinationer som har inträffat är udda, bildas en dimer av bakteriekromosomen, medan det vid ett jämnt antal rekombinationer bildas två katenerade (kopplade till varandra) kromosomer. I det andra fallet leder separationen av katenaner med topoisomeras IV till fullständig separation av dotterkromosomerna, medan detta inte är tillräckligt när det gäller den bakteriella kromosomdimeren. Separation av dimeren för att bilda monomerer sker som ett resultat av platsspecifik rekombination vid platsen dif under verkan av resolvas (platsspecifikt rekombinas) XerCD.
^

4.2.2 Reglering av replikering av plasmiden ColE1

Många prokaryota celler innehåller, förutom huvudkromosomen, litet extrakromosomalt DNA som kallas plasmider. Plasmider, vars storlek varierar från flera tusen till hundratusentals baspar, och antalet kopior per cell - från ett till flera hundra, är kapabla till autonom (oberoende av huvudkromosomen) replikering och ärvs stabilt i ett antal cellgenerationer. Även om många plasmider ger värdceller påtagliga selektiva fördelar (resistens mot antibiotika, tungmetaller etc.), är de flesta av dem kryptisk, dvs. manifesteras inte i den synliga fenotypen av celler. Eftersom deras existens är en betydande belastning på metabolismen av värdceller, förblir innebörden av deras evolutionära stabilitet oklar. Trots det faktum att bakterieceller under naturliga förhållanden inte verkar uppleva selektionstryck som syftar till att bibehålla plasmider inuti celler, segregerar de senare stabilt mellan dotterbakterieceller med hjälp av subtila mekanismer som reglerar antalet kopior i cellerna.

Ursprunget för replikering av den lilla plasmiden ColE1 som bär gener för kolicinresistens används traditionellt inom genteknik för konstruktion av vektor-DNA-molekyler, som används för kloning och uttryck av korta nukleotidsekvenser i E. coli-celler. Det är därför det är lämpligt att överväga för ColE1-plasmiden.

^ Initiering av replikering av ColE1-plasmiden. Replikering av ColE1-plasmiden sker i en riktning (enriktad replikering) med användning av värdcellens replikationsapparat. I sig själv kodar inte plasmiden för något av de enzymer som skulle behövas för dess replikation. Ursprunget för replikation innehåller två promotorer, av vilka en tillhandahåller syntesen av RNA-primern (RNA II) som krävs för att initiera plasmidreplikation. Det syntetiserade RNA II, vars längd beror på typen av plasmid som replikeras, bearbetas vidare av RNas H för att bilda ett RNA med en längd på 550 nukleotider. Denna molekyl används effektivt av DNA-polymeras I som en primer i syntesen av den ledande DNA-strängen. I frånvaro av RNas H tjänar 3'-änden av RNA II som en primer under replikation, men med mindre effektivitet. I celler som är defekta i RNas H och DNA-polymeras initieras ColE1-replikation av DNA-polymeras III med deltagande av RNA II enligt mekanismen som diskuterats i detalj ovan.

Alla tre mekanismerna för initiering av plasmidreplikation är baserade på den unika egenskapen hos RNA II för att bilda en stabil DNA-RNA-hybrid vid replikationsstarten. I själva verket frisätts normala transkript från transkriptionskomplexet efter att transkriptionen är fullbordad och RNA-polymeraset separeras från mallen, vilket inte är fallet med RNA II. Analys av replikationsdefekta plasmidmutanter, såväl som deras revertanter, visade att i den stabila RNA II-hybriden med mallen sker en interaktion mellan den G-rika loopen av RNA II, bildade 265 nukleotider uppströms om replikationsstartpunkten (position –265), och den C-rika regionens DNA belägen i närheten av nukleotid -20 (Fig. I.48, a). Båda dessa sekvenser konserverades i de besläktade plasmiderna pMBl, p15A och KSF1030. Interaktioner mellan dessa sekvenser tycks inträffa i det ögonblick då RNA-polymeraset fortfarande är i transkriptionskomplexet och DNA-kedjorna i närheten av komplexet är otvinnade. Balansen mellan de två alternativa konformationerna av RNA II är avgörande för att bestämma andelen RNA-molekyler som finns kvar i DNA-RNA-hybriden som behövs för att initiera plasmidreplikation. Valet mellan två alternativa konformationer av RNA II bestäms av den primära strukturen i regionen som ligger mellan nukleotiderna –359 och –380 (sekvens ) (se Fig. I.48, b). Denna sekvens kan interagera med den komplementära sekvensen  som ligger ovanför (struktur ) eller med den homologa sekvensen  som ligger nedanför (struktur ). Efter att RNA-polymeras transkriberar de första 200 nukleotiderna, bildar det resulterande RNA II en temporär sekundär struktur som kännetecknas av närvaron av tre stam-loop-domäner (I, II och III). Förlängning av RNA II med några fler nukleotider leder till att stam III förstörs och stam IV bildas, som stabiliseras som ett resultat av komplementära interaktioner mellan - och -sekvenserna. Under den efterföljande förlängningen av RNA II har den två alternativa möjligheter att bilda sin sekundära struktur. Valet till förmån för en eller annan konformation beror på om -sekvensen förblir associerad med -sekvensen eller om den bildar nya kontakter med -sekvensen. Övergången från komplementära par  till  åtföljs av starka förändringar i konformationen av RNA II, vilket i slutändan bestämmer dess förmåga att fungera som en primer under plasmidreplikation. RNA II-molekyler i -konformationen kan bilda en RNA-DNA-hybrid som fungerar som ett substrat för RNas H, medan de i -konformationen inte har denna förmåga. Den föreslagna modellen stöds främst av det faktum att mutationer som gynnar bildandet av -konformationen på grund av stam IV-destabilisering hindrar RNA II-funktionen som en primer och leder till en minskning av antalet kopior av ColE1-plasmiden inuti bakterieceller . Dessa replikationsbristiga mutantplasmider aktiveras av suppressormutationer som stabiliserar stam IV. Sålunda beror initieringen av replikering av ColE1-plasmiden på förmågan hos RNA II att bilda en RNA-DNA-hybrid nära replikationsursprunget (ori). Samtidigt påverkas bildandet av en hybrid av sekundära och tertiär struktur uppströms om nukleotidsekvensen för primerprekursorn.

^ Ris. I.48. Replikationsregleringsschema för plasmid ColE1

a– förmodad sekundär struktur av RNA II, efter transkription med RNA-polymeras  500 nukleotider av plasmid-DNA; ytterligare förlängning av RNA II åtföljs av bildandet av en DNA-RNA-hybrid (fet pil) mellan RNA II och transkriberat DNA;

bär en möjlig mekanism för att kontrollera plasmidreplikation. Den övre delen av figuren visar en genetisk karta över den DNA-region som krävs för att initiera och kontrollera plasmid-DNA-replikation. De rumsliga strukturerna för två inhibitorer av plasmidreplikation: RNA I och protein Rop presenteras schematiskt. Den nedre delen visar två alternativa konformationer av RNA II, bildade under verkan av RNA I, I-X är element i den sekundära strukturen
^ Kontroll av antalet kopior av plasmiden ColE1. Kontrollen av initieringen av replikation av plasmiden ColE1 utförs huvudsakligen på nivån av förändringar i den rumsliga strukturen av RNA II. Eftersom plasmider styr sin egen biosyntes, d.v.s. deras replikering fortskrider genom en autokatalytisk mekanism, postulerades det att initieringen av ColE1-replikation är under påverkan av en hämmare som kodas av plasmiden, vars koncentration i cellen är ju högre, ju fler intracellulära kopior av plasmiden. . Faktum är att analysen av mekanismerna för replikering av mutantplasmider, som kännetecknas av ett högt antal kopior, gjorde det möjligt att identifiera två Trans- verkande faktorer som kodas av plasmiden och som påverkar replikeringen av plasmiden in vivo.

Den huvudsakliga replikationshämmaren var ett litet RNA 108 nukleotider långt, kallat RNA I, helt komplementärt till den 5'-terminala sekvensen av primerprekursorn (RNA II). Promotorn för RNA I-genen är belägen i regionen för replikationsursprunget för ColEl-plasmiden och är riktad i motsatt riktning med avseende på RNA II-promotom (se Fig. I.48). Komplementära interaktioner mellan RNA I och RNA II påverkar bildandet av den rumsliga strukturen av RNA II på ett sådant sätt att βγ-konformationen preferentiellt uppstår, som är inaktiv med avseende på initiering av replikation (se Fig. I.48, b, nere till höger).

Interaktionen mellan RNA I och RNA II sker produktivt endast så länge som ett kort RNA II-transkript som inte är längre än 80 nukleotider syntetiseras. Även om interaktionen av RNA I med en så kort sekvens av nukleotider är långsammare än med ett transkript på 360 nukleotider i längd, i det senare fallet påverkar RNA I inte konformationen av den 5'-terminala delen av RNA II och dess förmåga att fungera som en primer vid plasmidreplikation (konformation αβ, Fig. I.48, b, nedre vänstra). Av detta är det tydligt att hastigheten för bildning av hybrider mellan RNA I och RNA II är avgörande för den effektiva funktionen av mekanismen för reglering av plasmidreplikation. Processen för interaktion mellan RNA I och RNA II har nu studerats i detalj. Det går igenom bildandet av flera mellanprodukter och kulminerar i en stabil hybrid mellan fullt komplementärt RNA I och den 5'-terminala regionen av RNA II.

^ RNA-organiserande protein Rop. Genen för den andra komponenten, som negativt reglerar replikationen av ColE1-plasmiden, kartläggs direkt bakom replikationsursprunget. Denna gen kodar för ett 63-bp protein som kallas Rop (repressor of primer) som finns i lösning som en dimer. Både in vivo och in vitro förstärker Rop den hämmande aktiviteten av RNA I utan att påverka syntesen av RNA II. Samtidigt påverkar Rop de initiala faserna av interaktionen mellan RNA I och RNA II, vilket underlättar övergången av en mycket instabil mellanprodukt C* till en mer stabil, Cm*. Rop-proteinet har hög affinitet för C* och interagerar endast svagt med isolerade RNA I och RNA II in vitro. Det antas att Rop uppvisar liten specificitet med avseende på nukleotidsekvenser och känner igen några gemensamma drag i strukturen av RNA I-RNA II-komplexet som uppstår i de tidiga stadierna av deras interaktion. Rop-proteinets funktioner består uppenbarligen i omvandlingen av ett instabilt RNA-RNA-komplex till ett mer stabilt, vilket i sin tur åtföljs av undertryckande av bildandet av primern som är nödvändig för att initiera replikationen av ColE1-plasmid.

Användningen av antisens-RNA vid kontroll av bakteriell plasmidreplikation är en vanlig teknik. I synnerhet kontrolleras replikering av den lilla, lågkopierade R1-plasmiden av RepA-proteinet, som är involverat i initieringen av plasmidreplikation som en positiv regulatorisk faktor. RepA-syntes i sin tur regleras post-transkriptionellt av det lilla antisens-RNA:t CopA, som binder till RepA-mRNA i en flerstegsreaktion som påminner om fusionen mellan RNA I och RNA II som diskuterats ovan. Denna interaktion undertrycker genuttryck. repa, möjligen på grund av klyvning av RNA-RNA-duplexet av RNas III. Den intracellulära koncentrationen av antisens-CopA-RNA är direkt proportionell mot kopieantalet för R1-plasmiden. En liknande mekanism har beskrivits för regleringen av initieringen av replikation av Staphylococcus aureus pT181-plasmiden.

När man skaffar bakterievektorer för genteknik, av vilka många innehåller ursprunget till replikation av ColE1-plasmiden, används ofta hämmare av proteinbiosyntes, i synnerhet kloramfenikol, för att öka antalet kopior i bakterieceller. Efter att ha diskuterat mekanismerna för reglering av replikationskontrollen av denna plasmid, blir principerna på vilka denna teknik är baserad tydliga. Faktum är att införandet av kloramfenikol i odlingsmediet blockerar biosyntesen av bakteriella proteiner, inklusive Rop-proteinet, vilket är nödvändigt för att effektivt undertrycka initieringen av plasmidreplikation under verkan av RNA I. för detta ändamål försyntetiserade bakterieproteiner.

Det är känt att två fenotypiskt olika plasmider som använder samma replikationskontrollmekanism är inkompatibla i samma bakteriecell. Celler som innehåller två plasmider från olika kompatibilitetsgrupper bildar snabbt två populationer under förökningen, var och en innehåller endast en typ av plasmid. Detta beror på det slumpmässiga urvalet av plasmider för replikering i bakterieceller och den slumpmässiga fördelningen av den initiala poolen av plasmider till dotterceller. Den evolutionära uppkomsten av en mekanism för att kontrollera replikationen av bakteriella plasmider med användning av antisens-RNA har utökat möjligheterna för uppkomsten av plasmider som tillhör olika kompatibilitetsgrupper och samexisterar i samma bakterieceller. Trots att samma mekanism används, kommer antisens-RNA med olika nukleotidsekvenser inte att kunna känna igen "främmande", heterologa mål-RNA. Detta tillåter sådana plasmider att samexistera i en bakteriecell och skapar förutsättningar för deras bredare distribution i naturliga populationer av mikroorganismer.

Typiska exempel på en ökning av antalet gener på grund av deras selektiva replikation är förstoring rRNA-gener och förändringar i antalet gener som bestämmer cellresistens mot läkemedel. I det första fallet åtföljs förlusten av en del av rRNA-generna i Drosophila som ett resultat av deletion av en gradvis återställning av deras antal, medan i det andra fallet ökar antalet kopior av generna som är nödvändiga för dess neutralisering i celler under villkoren för den selektiva verkan av ett läkemedel som är giftigt för dem. I synnerhet är detta karakteristiskt för dihydrofolatreduktasgenen i närvaro av metotrexat. Det föreslås att förändringen i antalet kopior av sådana gener är baserad på mekanismen för ojämn korsning.

extracellulärt biologiskt intracellulärt rymdmembranutrymme

Orsaken till kikhosta och parapertussis. Karakterisering av deras egenskaper. patogenes av kikhosta. Mikrobiologisk diagnostik. specifik profylax.

Den genetiska apparaten för bakterier (kromosomer, plasmider) är en egenskap hos bakteriella transposoner. Plasmidernas biologiska roll.

DNA-replikation är processen att syntetisera en dottermolekyl av deoxiribonukleinsyra på mallen för moder-DNA-molekylen. Under den efterföljande delningen av modercellen får varje dottercell en kopia av en DNA-molekyl som är identisk med den ursprungliga modercellens DNA. Denna process säkerställer korrekt överföring av genetisk information från generation till generation. DNA-replikation utförs av ett komplext enzymkomplex, bestående av 15-20 olika proteiner, kallat replisomen.

Studiens historia

Varje DNA-molekyl består av en sträng av den ursprungliga modermolekylen och en nysyntetiserad sträng. En sådan replikationsmekanism kallas semi-konservativ. Denna mekanism anses nu vara bevisad tack vare Matthew Meselsons och Franklin Stahls (1958) experiment. Tidigare fanns det två andra modeller: "konservativ" - som ett resultat av replikering bildas en DNA-molekyl, som endast består av moderkedjor, och en, som endast består av barnkedjor; "dispersiv" - alla DNA-molekyler som härrör från replikation består av kedjor, av vilka vissa sektioner är nysyntetiserade, medan andra är tagna från moder-DNA-molekylen.

Allmänna framställningar

DNA-replikation är en nyckelhändelse under celldelningens gång. Det är viktigt att DNA:t replikeras fullständigt vid tidpunkten för delningen och endast en gång. Detta tillhandahålls av vissa mekanismer för reglering av DNA-replikation. Replikering sker i tre steg:

replikeringsinitiering

förlängning

avbrytande av replikering.

Replikering regleras huvudsakligen vid initieringsstadiet. Detta är ganska lätt att implementera, eftersom replikering inte kan börja från vilket DNA-segment som helst, utan från ett strikt definierat, som kallas platsen för replikationsinitiering. I genomet kan det finnas antingen bara en eller många sådana platser. Begreppet replikationsinitieringsställe är nära besläktat med begreppet replikon. Ett replikon är en DNA-sträcka som innehåller ett ställe för replikationsinitiering och replikerar efter starten av DNA-syntes från denna plats. Bakteriegenom är som regel ett enda replikon, vilket betyder att replikeringen av hela genomet är resultatet av bara en replikationsinitiering. Eukaryota genom (liksom deras individuella kromosomer) består av ett stort antal oberoende replikoner, minskar detta avsevärt den totala tiden för replikering av en enda kromosom. De molekylära mekanismerna som styr antalet replikationsinitieringar vid varje ställe per celldelningscykel kallas kopietalskontroll. Förutom kromosomalt DNA innehåller bakterieceller ofta plasmider, som är individuella replikoner. Plasmider har sina egna mekanismer för kontroll av antal kopior: de kan tillhandahålla syntesen av bara en kopia av plasmiden per cellcykel, eller tusentals kopior.

Replikationen börjar vid platsen för replikationsinitiering med avvecklingen av DNA-dubbelhelixen, vilket bildar en replikationsgaffel, platsen för direkt DNA-replikation. Varje plats kan bilda en eller två replikeringsgafflar, beroende på om replikeringen är enkelriktad eller dubbelriktad. Dubbelriktad replikering är vanligare. En tid efter starten av replikationen kan ett elektronmikroskop användas för att observera ett replikationsöga - en region av kromosomen där DNA redan har replikerats, omgivet av mer utsträckta regioner av oreplikerat DNA.

I replikationsgaffeln kopierar DNA ett stort proteinkomplex (replisom), vars nyckelenzym är DNA-polymeras. Replikationsgaffeln rör sig med en hastighet av cirka 100 000 baspar per minut i prokaryoter och 500-5000 i eukaryoter.

Molekylär replikationsmekanism

Enzymer (helikas, topoisomeras) och DNA-bindande proteiner lindar upp DNA, håller matrisen i ett utspätt tillstånd och roterar DNA-molekylen. Korrektheten av replikationen säkerställs av den exakta matchningen av komplementära baspar och aktiviteten av DNA-polymeras, som kan känna igen och korrigera felet. Replikation i eukaryoter utförs av flera olika DNA-polymeraser. Därefter vrids de syntetiserade molekylerna enligt principen om supercoiling och ytterligare komprimering av DNA. Syntes är energikrävande.

DNA-molekylens kedjor divergerar, bildar en replikationsgaffel, och var och en av dem blir en mall på vilken en ny komplementär kedja syntetiseras. Som ett resultat bildas två nya dubbelsträngade DNA-molekyler, identiska med modermolekylen.

Egenskaper för replikeringsprocessen

matris - sekvensen för den syntetiserade DNA-kedjan bestäms unikt av sekvensen för moderkedjan i enlighet med komplementaritetsprincipen;

semi-konservativ - en kedja av DNA-molekylen som bildas som ett resultat av replikation är nysyntetiserad, och den andra är modern;

går i riktningen från 5'-änden av den nya molekylen till 3'-änden;

semi-kontinuerlig - en av DNA-kedjorna syntetiseras kontinuerligt, och den andra - i form av en uppsättning separata korta fragment (Okazaki-fragment);

börjar med vissa delar av DNA, som kallas replikationsinitieringsställen (engelsk ursprung).

Viktiga enzymer för DNA-replikation

Information / DNA-replikation / Grundläggande enzymer för DNA-replikation

DNA - polymeras

DNA-polymeras är ett enzym involverat i DNA-replikation. Enzymer av denna klass katalyserar polymerisationen av deoxiribonukleotider längs DNA-nukleotidkedjan, som enzymet "läser" och använder som mall. Typen av en ny nukleotid bestäms av principen om komplementaritet med mallen från vilken avläsningen utförs. Den sammansatta molekylen är komplementär till mallmonospiralen och identisk med den andra komponenten i dubbelhelixen.

Ett DNA-beroende DNA-polymeras isoleras med en av DNA-strängarna som mall och ett RNA-beroende DNA-polymeras, som också kan läsa information från RNA (omvänd transkription).

DNA-polymeras anses vara ett holoenzym eftersom det kräver närvaro av magnesiumjoner som en kofaktor för att fungera korrekt. I frånvaro av magnesiumjoner kan det hänvisas till som ett apoenzym.

DNA-polymeras börjar DNA-replikation genom att binda till ett segment av en kedja av nukleotider. Det genomsnittliga antalet nukleotider fästa av DNA-polymerasenzymer i en bindning/dissociation med mallen kallas processivitet.

DNA-ligaser

Ligas är ett enzym som katalyserar föreningen av två molekyler för att bilda en ny. kemisk bindning(ligering). I det här fallet sker vanligtvis en klyvning (hydrolys) av en liten kemisk grupp från en av molekylerna.

Ligaser tillhör EC 6-klassen av enzymer.

Inom molekylärbiologin delas ligaser in i två stora grupper - RNA-ligaser och DNA-ligaser. DNA-ligas för DNA-reparation

DNA-ligaser är enzymer som katalyserar den kovalenta tvärbindningen av DNA-strängar i en duplex under replikation, reparation och rekombination. De bildar fosfodiesterbryggor mellan 5'-fosforyl- och 3'-hydroxylgrupperna i intilliggande deoxinukleotider vid DNA-avbrott eller mellan två DNA-molekyler. För att bilda dessa broar använder ligaser energin från hydrolys av ATP-pyrofosforylbindningen. Ett av de vanligaste kommersiellt tillgängliga enzymerna är bakteriofag T4 DNA-ligas.

DNA - helikaser

DNA-helikaser - enzymer som varvar den dubbelsträngade DNA-spiralen med energiförbrukningen från hydrolysen av NTP-trifosfater. Det resulterande enkelsträngade DNA:t är involverat i olika processer såsom replikering, rekombination och reparation. DNA-helikaser är väsentliga för replikation, reparation, rekombination och transkription. Helikaser finns i alla organismer.

DNA topoisomeraser

DNA-topoisomeraser är enzymer som ändrar graden av supercoiling och typen av supercoil. Genom ett enkelsträngsbrott skapar de ett gångjärn runt vilket den oreplikerade duplexen av DNA framför gaffeln fritt kan rotera. Detta lindrar den mekaniska påfrestningen som skapas av avlindningen av de två strängarna i replikeringsgaffeln, vilket är nödvändigt tillstånd för dess kontinuerliga rörelse. Dessutom säkerställer topoisomeraser (typ II) separationen eller bildandet av katenaner - länkat cirkulärt DNA (bildat som ett resultat av cirkulär DNA-replikation), samt eliminering av knutar och tovor från långt linjärt DNA. Det finns två typer av topoisomeraser. Typ I-topoisomeraser minskar antalet superspolar i DNA med en enhet per akt. Dessa topoisomeraser hackar en av de två strängarna, vilket gör att de flankerande duplexområdena roterar runt den intakta strängen och sedan sammanfogar ändarna av den avskurna strängen. Denna reaktion kräver inte energin av ATP, eftersom. energin hos fosfodiesterbindningen bevaras på grund av det faktum att tyrosinresten i enzymmolekylen fungerar antingen som en acceptor eller som en donator av fosforyländen av den skurna kedjan.

Typ II-topoisomeraser introducerar tillfälliga brott i båda komplementära strängarna, passerar ett dubbelsträngat segment av samma eller en annan DNA-molekyl genom brottet och förenar sedan de brutna ändarna. Som ett resultat tas två positiva eller negativa superspolar bort i en akt. Typ II topoisomeraser använder också tyrosinrester för att länka 5¢-änden av varje bruten kedja vid den tiden. när en annan duplex passerar genom gapet.

Primaza

Primas är ett enzym med RNA-polymerasaktivitet; tjänar till att bilda RNA-primrar som är nödvändiga för att initiera DNA-syntes vid ori-punkten och vidare för att syntetisera den eftersläpande strängen.

Baserat på moder-DNA-molekylen. DNA-replikation utförs av ett komplext komplex bestående av 15-20 olika enzymproteiner som kallas replisom (Engelsk) Med hjälp av speciella enzymer tvinnas den dubbla helixen av moderns DNA till två strängar, på varje sträng som bildas fullbordas en andra sträng som bildar två identiska dotter-DNA-molekyler, som sedan vrids i separata spiraler. Under den efterföljande delningen av modercellen får varje dottercell en kopia av en DNA-molekyl som är identisk med den ursprungliga modercellens DNA. Denna process säkerställer korrekt överföring av genetisk information från generation till generation.

Studiens historia

Varje DNA-molekyl består av en sträng av den ursprungliga modermolekylen och en nysyntetiserad sträng. En sådan replikationsmekanism kallas semi-konservativ. För närvarande anses denna mekanism bevisad tack vare Matthew Meselsons och Franklin Stahls (d.) experiment. Tidigare fanns det två andra modeller: "konservativ" - som ett resultat av replikering bildas en DNA-molekyl, som endast består av moderkedjor, och en, som endast består av barnkedjor; "dispersiv" - alla DNA-molekyler som härrör från replikation består av kedjor, av vilka vissa sektioner är nysyntetiserade, medan andra är tagna från moder-DNA-molekylen. DNA-molekylen skärs på mitten och två mallar bildas. Två mallar kommer ut ur replikeringsgaffeln. Om du föreställer dig dem i en uträtad form, kan du se en rad kammar som är anslutna i ändarna, men som har ett gap. Föreställ dig att den ena kammen är blå och den andra är röd. Låt oss nu ersätta den nedre röda (den är gjord av fem åsar, som den övre) med den femte änden till den tredje övre (tredje övre nålen). Förläng kedjan både upptill och nedtill. Hur skulle det bli: fem, tre, fem osv - över och under också. Sedan läggs ytterligare två mallar till dessa kammar efter att mallarna (kammarna) lämnar replikeringsgaffeln. Från en DNA-molekyl är två molekyler identiska med föräldern (om det inte finns några mutationer), detta kallas semi-konservativt.

Allmänna framställningar

replikeringsinitiering
förlängning
avbrytande av replikering.

Replikering regleras huvudsakligen vid initieringsstadiet. Detta är ganska lätt att göra, eftersom replikering inte kan börja från något DNA-segment, utan från ett strikt definierat, kallat replikationsinitieringsstället. I genomet kan det finnas antingen bara en eller många sådana platser. Nära relaterat till begreppet replikeringsinitieringsplats är begreppet replikon . Ett replikon är en DNA-sträcka som innehåller ett ställe för replikationsinitiering och replikerar efter starten av DNA-syntes från denna plats. Bakteriegenom är vanligtvis ett enda replikon, vilket innebär att replikeringen av hela genomet är resultatet av bara en replikationsinitiering. Eukaryota genom (liksom deras individuella kromosomer) består av ett stort antal oberoende replikoner, vilket avsevärt minskar den totala tiden för replikering av en enskild kromosom. De molekylära mekanismerna som styr antalet replikationsinitieringar vid varje ställe per celldelningscykel kallas kopietalskontroll. Förutom kromosomalt DNA innehåller bakterieceller ofta plasmider, som är individuella replikoner. Plasmider har sina egna kopieringskontrollmekanismer: de kan tillhandahålla syntesen av bara en kopia av plasmiden per cellcykel och tusentals kopior.

Replikation börjar vid platsen för replikationsinitiering med avvecklingen av DNA-dubbelhelixen, som bildas replikeringsgaffel är platsen för direkt DNA-replikation. Varje plats kan bilda en eller två replikeringsgafflar, beroende på om replikeringen är enkelriktad eller dubbelriktad. Dubbelriktad replikering är vanligare. En tid efter starten av replikationen kan man observera i ett elektronmikroskop replikeringsöga - en region av kromosomen där DNA redan har replikerats, omgiven av mer utsträckta regioner av oreplikerat DNA.

Vid replikationsgaffeln kopierar DNA ett stort proteinkomplex (replisom), vars nyckelenzym är DNA-polymeras. Replikationsgaffeln rör sig med en hastighet av cirka 100 000 baspar per minut i prokaryoter och 500-5000 i eukaryoter.

Enzymer och deras funktioner

Enzym	Fungera
DNA-gyras	Introducerar tillfälliga dubbelsträngsbrott i DNA, vilket underlättar dess avveckling.
helikas	Delar strängarna av en dubbelsträngad DNA-molekyl i enkelsträngar.
SSB-proteiner	De binder enkelsträngade DNA-fragment och förhindrar komplementär parning.
Primaza	Den syntetiserar en RNA-primer (primer) - ett kort fragment av RNA, som är initiatorn i arbetet med DNA-polymeras (polymeraset kan inte syntetisera DNA från grunden, men kan lägga till nukleotider till befintliga).
DNA-polymeras	Syntetiserar DNA genom att binda till en primer. Det bör noteras att polymeraset syntetiserade ena änden av moderns DNA kontinuerligt och i en riktning, och den andra änden, i motsatt riktning, som fragment.
Squirrels glidklämma (fästen)	De omger DNA-ringen och "glider" längs den tillsammans med DNA-polymerasenzymet som rör sig framåt. De förhindrar dissociation av enzymet från DNA-mallen och ökar dess effektivitet.
RNase H	Raderar redan onödiga fragment av RNA-primer.
DNA-ligas	Syr DNA-fragment (Okazaki-fragment).
Telomeras	Lägger till speciella repetitiva nukleotidsekvenser till ena änden av DNA-kedjan i telomerregioner, och kompenserar därigenom för deras förkortning under delning.
Replisome (komplex av alla replikationsenzymer)	Den rör sig längs DNA-matrismolekylen, lindar upp den och bygger upp komplementära DNA-kedjor.

Spivak Irina Mikhailovna

DNA-replikation

Introduktion

Det genetiska programmet för alla levande organismer, med undantag för RNA-virus, är skrivet i DNA-nukleotidsekvensen. Därför, för att bevara organismens unika egenskaper, är det nödvändigt att exakt reproducera denna sekvens i varje efterföljande generation. E. coli, till exempel, bör duplicera nästan utan fel komplett genom storlek 4·106 nukleotidpar under bildningen av varje efterföljande generation; på samma sätt måste nästan 4 x 10 9 baspar kopieras i 23 par mänskliga kromosomer under varje celldelningshändelse. Den huvudsakliga egenskapen hos DNA är att det fungerar som en mall och bestämmer i vilken ordning nukleotiderna radas upp i nya polynukleotidsträngar.

Egentligen är DNA-replikation i vid bemärkelse en mycket viktig process för en cell som delar sig. Det inkluderar också beredning av kromatin för replikering och förebyggande av upprepad mitos. Detta säkerställer en enda DNA-duplicering under en cellcykel, vilket bibehåller genomets stabilitet.

Levande organismers genetiska stabilitet bestäms till stor del av funktionen hos komplexet av proteiner som utför DNA-replikation. Uppenbarligen regleras DNA-replikation av en mängd olika protein-protein- och DNA-protein-interaktioner, vars mekanism förblir okänd. Dessutom fungerar DNA-replikationskomplexet i samverkan med proteinkomplex som reparerar DNA-skador. Samtidigt åtföljs processen att överföra information från föräldraorganismen till barnet av rekombination av DNA-molekyler för att skapa större ärftlig mångfald. Processen för DNA-rekombination beskrivs i detalj under meiotisk korsning under bildandet av könsceller, under V(D)J-rekombination - processen för bildning av olika gener av immunglobuliner och immunglobulinreceptorer, under verkan av vissa DNA-reparationssystem. Med hänsyn till all mångfald och konsistens i processerna för DNA-metabolism, kan man anta en ännu större mångfald och komplex interaktion av proteinkomplex som utför stabil reproduktion av ärftligt material i generationer.

Det är viktigt att inse att DNA kodar för information om mekanismen för dess egen duplicering: vissa gener kodar för enzymer som syntetiserar nukleotidprekursorer till DNA, medan andra kodar för proteiner som sätter ihop aktiverade nukleotider till polynukleotidkedjor. Det finns gener som koordinerar replikationsprocessen med andra cellulära händelser, såväl som gener som kodar för proteiner som packar DNA till kromatin.

Att förstå regleringen och dynamiken i dessa system är en viktig utmaning för molekylärbiologin på 2000-talet.

Kapitel 1. Replikation - polymerasreaktion

När de publicerade sin modell av DNA-strukturen 1953, skrev James Watson och Francis Crick: "Vi kunde inte annat än vara medvetna om att den specifika basparning vi postulerade innebär någon mekanism för att kopiera teistiskt material." De var de första som noterade: "Om du vet den exakta ordningen på baserna i en av kedjorna, kan du skriva ner ordningen på baserna i den andra, eftersom basparningen är specifik. Således är den ena strängen komplementet till den andra; det är denna egenskap som tyder på att DNA kan duplicera sig självt."

Watson och Crick föreslog att för att DNA ska dupliceras måste vätebindningarna som håller ihop den spiralformade duplexen brytas och strängarna separeras. De föreslog också att varje duplexsträng fungerar som en mall för syntesen av en komplementär sträng, och som ett resultat bildas två par strängar, som var och en har endast en förälder. Detta är mekanismen för att exakt reproducera sekvensen av nukleotidpar i DNA-dubbelhelixen. Watson och Crick trodde att DNA-replikation utförs spontant, utan deltagande av enzymer, men detta visade sig vara felaktigt. Men idén att DNA-duplicering sker genom att koppla nukleotider i serie enligt komplementaritetsregeln som ges av varje sträng i helixen löste det konceptuella problemet med att exakt reproducera gener.

Enligt den allmänt accepterade modellen är replikationen av allt dubbelsträngat DNA semi-konservativ. Om det finns alternativa sätt att replikera dubbelsträngat DNA i naturen (till exempel konserverat eller dispergerat) är okänt. Efter varje replikationshändelse är således en sträng i båda dottermolekylerna föräldern, konservativ, och den andra är den nysyntetiserade dottern. Det är denna kopieringsmekanism som kallas halvkonservativ. Om genomet representeras av enkelsträngat DNA (som i vissa virus), så fungerar denna enkelsträng som mall för bildandet av en komplementär sträng med vilken den bildar en duplex, och sedan antingen barnduplex eller enkelsträngade kopior av en av matrissträngarna syntetiseras på denna duplex.

Watson och Crick föreslog redan i sitt andra arbete 1953 en möjlig mekanism för att kopiera ärftligt material. Det är lätt att föreställa sig att en DNA-molekyls kedjor divergerar och var och en av dem blir en mall på vilken en ny komplementär kedja syntetiseras. Som ett resultat bildas två dubbelsträngade dotter-DNA-molekyler, som inte går att skilja från modermolekylen.

1957 upptäckte A. Kornberg i bakterier E coli ett enzym som katalyserar processen för DNA-polymerisation från nukleotider - DNA-polymeras 1. 1959 tilldelades Arthur Kornberg (A. Kornberg) Nobelpriset för att ha upptäckt mekanismen för DNA-biosyntes. Han visade att dubbleringen av DNA-molekyler bygger på vanliga biokemiska reaktioner.

I allmänna termer kan additionsreaktionen av 5'-deoxinukleotidgruppen till 3'-OH-gruppen i den terminala nukleotiden i primerkedjan representeras enligt följande:

N + dNTP<->n+1 + PP i

där dNMP är någon av de fyra vanliga nukleotiderna. Under en replikationsakt förlängs strängen som innehåller 3'-änden med en nukleotidrest, medan pyrofosfat avlägsnas samtidigt. Nukleotidadditionsreaktionen är reversibel, men eftersom oorganiskt fosfat i celler snabbt förstörs, är reaktionen aktivt riktad mot syntes. DNA-replikation fortsätter alltid från 5'-änden av DNA-strängen (det vill säga innehåller 5'-deoxinukleotidgruppen) till 3'-änden (dvs innehåller den fria 3-OH-gruppen) och kräver närvaro av ett tidigare syntetiserat DNA strängfragment som en primer för reaktionspolymerisationen. Ett sådant DNA-fragment som har en fri 3'-ände kallas en primer. Enzymer som katalyserar den primerberoende, mallbestämda additionsreaktionen av deoxinukleotider kallas DNA-polymeraser. Hittills har flera olika klasser av DNA-polymeraser isolerats och karakteriserats, och egenskaperna hos dessa enzymer och de reaktioner de katalyserar har beskrivits i detalj. Vi kommer att prata i detalj om deras struktur och individuella egenskaper i följande kapitel.

1.1. Replikationsgaffel

Replikeringsprocessen sker i speciella strukturer som kallas replikeringsgafflar. Det schematiska arrangemanget av E. coli-replikationsgaffeln visas i fig. 1. Det faktum att två strängar av DNA-molekylen är placerade antiparallellt med varandra skapar ett antal problem för deras samtidiga flerriktade replikation.

När gaffeln rör sig måste två underordnade trådar syntetiseras samtidigt. Gaffeln rör sig i riktning från 5 " till 3' på en kedja och från 3 ’ till 5" - på den andra. Dock nukleinsyror syntetiseras endast från 5" till 3" änden. Problemet löses på så sätt att på en av föräldratrådarna syntetiseras en ny tråd kontinuerligt i 5"-3" riktningen, vilket sammanfaller med replikeringsgaffelns rörelse. Detta kallas att leda eller leda. Den andra tråden kallas lagging eller lagging, eftersom syntesen på den sker med viss fördröjning jämfört med den inledande tråden. Detta beror på det faktum att DNA på denna sträng också syntetiseras från 5" till 3", men i motsatt riktning mot gaffelns rörelse, och i korta fragment. På grund av detta kan flerriktad DNA-syntes utföras inom samma struktur - replikationsgaffeln.

Ris. 1. Schema för replikeringsgaffeln.

Längden på sådana korta fragment i prokaryoter är 1000–2000 bp. De kallades "Okazaki-fragment" efter vetenskapsmannen som upptäckte dem. När replikeringsgaffeln rör sig förenas ändarna av intilliggande Okazaki-fragment för att bilda en kontinuerlig eftersläpande sträng. För att processen ska fortskrida synkront på båda trådarna är polymeraskomplexen av de främre och eftersläpande trådarna sammankopplade och bildar en komplex tredimensionell struktur (fig. 1, b).

Replikeringsgaffeln kan röra sig antingen i en riktning från replikeringsstartpunkten eller i båda riktningarna. Beroende på detta kallas processen enkelriktad eller dubbelriktad replikering. Hur detta ser ut schematiskt visas i fig. 2. I eukaryoter är replikationen vanligtvis dubbelriktad. Även kl E coli.

Mekanismerna för replikationsinitiering vid replikationsursprunget och bildandet av Okazaki-fragment i den eftersläpande strängen är i princip lika, även om det finns några subtila skillnader. I båda fallen bildas korta RNA-primrar. ( primers ), komplementärt mall-DNA, i form av en fortsättning på vilken en ny DNA-sträng syntetiseras. Därefter ersätts korta RNA-insättningar av DNA-segment, individuella Okazaki-fragment kombineras sedan för att bilda en kontinuerlig eftersläpande sträng.

Alla levande organismer på jorden delas vanligtvis in i prokaryoter och eukaryoter (från grekiska karyon - kärnan). Huvud funktion prokaryoter är frånvaron i dem, till skillnad från eukaryoter, av en fullfjädrad cellkärna täckt med ett membran. Det genetiska materialet hos prokaryoter finns i nukleoiden, den primitiva motsvarigheten till den eukaryota kärnan. Prokaryota celler är mycket små - cirka 1 mikron. Volymen av eukaryota celler är 800-1000 gånger större än volymen av prokaryota celler. Prokaryoter inkluderar bakterier och archaea (eller archaea), vars förfäder uppstod för cirka 4 miljarder år sedan. Eukaryoter kan vara antingen encelliga eller flercelliga. De dök upp på jorden cirka 500 miljoner år efter prokaryoter.

Enligt moderna koncept har DNA-metabolismen i prokaryoter vissa skillnader från den i eukaryoter. Genom att beskriva processerna för replikering och rekombination kommer vi att betona dessa skillnader varje gång.

Kapitel 2 Starta replikering

DNA-replikation börjar inte vid någon slumpmässig punkt i molekylen, utan på specifika platser som kallas replikationsursprung eller ursprung. Kopieringsprocessen fortsätter genom bildandet av replikationsgafflar i en eller båda riktningarna tills DNA:t är helt duplicerat. I slutna cirkulära DNA-molekyler är nysyntetiserade strängar kovalent kopplade vid mötespunkterna för ökande replikationsgafflar eller vid den punkt där en enda gaffel återvänder till replikationsursprunget. Dottermolekyler divergerar som regel innan en ny replikeringsrunda börjar.

Genom lika varierande i storlek som genomet av SV40-viruset (5,2 kb), bakteriofag? (48,5 kb) och E. coli (4-10 3 kb) reproduceras som ett resultat av en initierande händelse som inträffar vid en viss punkt.

Ris. 2. Möjlig rörelse av replikeringsgaffeln.

I pro- och eukaryoter kan du hitta olika varianter på detta tema. Således har var och en av kedjorna i moderspiralen av animaliskt mitokondrie-DNA (15 kb) sitt eget replikationsursprung. Syntes av den komplementära kedjan av några små enkelsträngade faggenom börjar nära en specifik sekvens, och replikering av den resulterande duplexen kan initieras vid en helt annan punkt. Replikation av linjärt dubbelsträngat DNA initieras också vid specifika ställen. Till exempel replikerar bakteriofag T7 DNA (40 kb) i två motsatta riktningar till olika ändar av molekylen, med början från en punkt, och var och en av de två humana adenovirus DNA-strängarna (30–38 kb) replikerar sekventiellt alltid från 3'-änden .

Genomen av eukaryota celler kännetecknas av närvaron av multipla replikationsstartpunkter utspridda längs kromosomen på ett avstånd av cirka 20 kb. Efter initiering fortsätter replikeringen i två riktningar från varje punkt tills replikeringsgafflarna för två intilliggande replikeringsstartpunkter går samman. Fullängds-DNA från varje dotterkromosom erhålls genom att sammanfoga kortare, oberoende initierade nysyntetiserade strängar.

2.1. Begreppet replikon och replikationsursprung

Det DNA-segment på vilket ett enda fragment av den ledande strängen syntetiseras kallas replikonen. I många prokaryoter innehåller deras genom bara ett replikationsursprung, det vill säga de har bara en replikon i sitt DNA. Eukaryota genom är polyreplikon.

Den plats där replikonen startar, där replikeringen initieras, kallas ursprunget för replikeringen. Det är ursprunget som känns igen av speciella proteinkomplex och bildandet av en replikationsgaffel börjar på det.

I vissa fall har replikationsursprunget en nukleotidsekvens så att duplexet antar en ovanlig konfiguration som känns igen av de proteiner som är involverade i initieringen. Naturen av interaktionen mellan ursprunget för replikation och proteiner och initieringsmekanismen som helhet har inte studerats tillräckligt, men det kan sägas att de uppenbarligen är olika i olika fall.

2.2. E.coIi oriC replikationsursprung

Ursprunget till E. coli och Bacillus subtilis har studerats i största detalj. Ursprunget för kromosomreplikation, oriC (origin of chromosom), inkluderar regioner med specifika sekvenser, de så kallade DNA-boxarna och korta sekvenser som ligger mellan dem. DNA-boxar med ett specifikt "motiv" av nukleotider, övervägande 9 bp, är varvat med fragment på 12-13 bp med hög halt av AT. De nio-ledade sekvenserna själva kan vara belägna både i en direkt och i en inverterad position i förhållande till varandra. Till exempel har B. subtilis ett TTATCACA-fragment och två andra nio-ledade lådor orienterade i motsatt riktning, med ett av basparen ändrat. Totalt har B. subtilis 15 DNA-boxar på oriC. OriC-regionen är mycket konserverad: DNA-lådor med liknande sammansättning finns på motsvarande plats i kromosomen i andra bakterier (endast i Mycoplasma genitalium, trots närvaron av replikationsenzymer som är gemensamma för alla bakterier, hittades inga DNA-lådor). Själva DNA-boxarna kodar inte för protein eller RNA, även om individuella gener finns mellan dem. Produkterna av dessa gener är också till stor del involverade i "underhållet" av DNA-replikationsprocessen.

Ordningen för arrangemang av DNA-lådor, mellanregioner och deras antal tyder på att den evolutionära divergensen av oriC främst berodde på duplikationer och tripplikationer. Schemat för det abstrakta "minimala ursprunget" för prokaryoter visas i fig. 3.

Ris. 3. Organisation av det minimala ursprunget för prokaryoter

Diagram över det minimala ursprunget för prokaryoter.

2.3. Andra organismers ursprung

Kärndelen av replikationsursprunget i SV40-viruset består av ett ursprungsigenkänningselement (ORE), som är nödvändigt för att binda ett specifikt T-antigen (T-ag)-protein, ett element för att binda ett DNA-avvecklingsprotein (DUE) och ett element anrikat på AT-nukleotider. Den punkt där replikeringsgaffeln börjar röra sig i motsatta riktningar kallas ursprunget för dubbelriktad replikering (OBR).

Hjälpelement (Aux) binder dimerer av T-antigen (Aux-1) och transkriptionsfaktor Sp1 (Aux-2). Avståndet mellan dessa element och deras orientering spelar en viktig roll i processen för replikeringsinitiering. Schemat för ursprunget för SV40-viruset visas i fig. fyra.

I eukaryoter är homologer av replikationsstarter autonomt replikerande sekvenser, eller ARS (autonomously replikerande sekvenser), upptäcktes 1980 av R. Davis och J. Carbon.

Ris. 4. Diagram över ursprunget för SV40-viruset.

I jästen Saccharomyces cerevisiae isolerades specifika sekvenser som kan säkerställa replikering av DNA-fragment i jästcellen tidigare än i andra eukaryoter. Senare hittades sådana sekvenser i många andra organismer. Hos S. cerevisiae tar ARS 100-200 bp och innehåller en specifik konsensussekvens (ACS - ARS konsensussekvens), 11 bp i storlek, nödvändig för att binda till initiatorproteinet, såväl som ytterligare element (B-element) som förstärker ursprungets funktion. Till exempel innehåller ARS1, det första ursprunget som karakteriseras i detalj, tre sådana element - B1, B2, B3. ACS- och B1-sekvenserna upptar cirka 50 bp och representerar den minsta funktionella regionen av något ursprung som krävs för att binda till ett initiatorprotein.

B2-elementet innehåller vanligtvis en genetiskt karakteriserad DUE-region. Hjälpelementet i OT binder transkriptionsfaktorn Abf-1. Den totala längden på ARS-elementet är 100-200 bp. Strukturen för S. cerevisiae-ursprunget visas i fig. 5.

Ris. 5. Diagram över ursprunget till Saccharomyces cereiseae

Hos en annan jästart, Shizosaccharomyces pombe, består ursprunget av minst en ARS, som är betydligt längre än den för S. cerevisiae. I vissa fall bildar flera ARS-element en ursprungszon för replikering. (Fig. 6.)

Ris. 6. Schema för ursprunget till Shizosaccharomyces pombe

Hos däggdjur har ursprung inte karakteriserats i detalj; några av dem är belägna i intergenluckor, har bindningsställen för transkriptionsfaktorer och innehåller ofta bara dubbelriktade replikationsinitieringsregioner (OBR).

2.4. Replikeringshastighet

Genomreplikationshastigheten regleras huvudsakligen av frekvensen av initierande händelser. Till exempel, i E. coli, är kopieringshastigheten i varje replikationsgaffel konstant och lika med cirka 1500 bp per sekund: följaktligen replikeras ett komplett genom 4 × 10 6 bp i längd på cirka 40 minuter. Om kromosomen replikerar snabbare betyder det att frekvensen av initieringshändelser vid samma replikationsursprung ökar med samma kopieringshastighet. E. coli-celler delar sig var 20:e minut; detta betyder att DNA-replikation initieras i kromosomer som ännu inte har avslutat den föregående replikeringsrunda. Rörelsehastigheten för replikationsgaffeln i eukaryota celler är mycket mindre (10-100 bp per sekund), men fullbordandet av kromosomreplikationen inom rimlig tid säkerställs genom samtidig initiering vid flera punkter. Så hastigheten för kromosomreplikation styrs av antalet och platsen för replikationsursprung. Till exempel, i tidiga Drosophila-embryon, sker replikeringen av en enda kromosom var 3:e minut på grund av den nästan samtidiga initieringen av händelser på punkter som är åtskilda 7000–8000 bp. Samtidigt är det känt att i Drosophila under tidig embryonal utveckling är både replikationshastigheten och storleken och antalet repliker vävnadsspecifika. I odlingen av somatiska celler av samma Drosophila är hastigheten för kromosomduplicering mycket långsammare, eftersom replikeringen börjar vid ett mycket mindre antal punkter belägna på ett avstånd av 40 000 bp från varandra, medan varaktigheten av S-fasen är 600 min. Därför, vid en fast hastighet av DNA-syntes, ökar multipel initiering hastigheten för den övergripande replikationsprocessen och minskar således tiden som krävs för att duplicera hela uppsättningen kromosomer. Data om antalet replikoner och replikeringshastigheten ges i tabell 1.

Skillnader i S-fasens varaktighet har även hittats hos andra organismer. Till exempel, i salamander, varar S-fasen 1 timme i blastulakärnorna och 200 timmar i den premeiotiska S-fasen av spermatocyter. Förmodligen bestäms varaktigheten av S-fasen inte av DNA-synteshastigheten, utan av antalet involverade replikationsursprung. I DNA från salamalamanderneurulaceller är de belägna på ett avstånd av cirka 40 µm från varandra och i somatiska celler cirka 100 µm.

bord 1

Antal och längd av replikoner i olika organismer.

I enlighet med moderna koncept är replikoner i eukaryoter inte slumpmässigt fördelade i genomet, de är ordnade i grupper (replicon foci). I dessa grupper, eller foci, sätts replikationsenzymer samman som förlänger replikationsgafflarna samtidigt av 10-100 närliggande replikoner, var och en ungefär 100 kb lång. Replikering i dem är klar på 45–60 min. Dessutom finns det mycket långa repliker (mer än 1000 kb), så stora att replikeringen i dem varar i flera timmar.

Aktivering av replikationsstarter sker under hela S-fasen. Till exempel aktiveras S. cerevisiae ARS1 i den tidiga S-fasen, medan ARS501 aktiveras i den sena S-fasen. De flesta origo aktiveras i mitten av S-fasen. Det är intressant att notera att segmenten av S. cerevisiae-kromosomer som replikerar i den tidiga eller sena S-fasen är ordnade i ett mosaikmönster, det vill säga de är blandade. I S. cerevisiae fann man att den centrala regionen av kromosom IV replikerar i den tidiga S-fasen, medan telomerer replikerar i den sena S-fasen. Ett 67 kb DNA-fragment intill telomeren vid den högra änden av kromosom V och innehållande ARS501 replikerar i den sena S-fasen. Tydligen är den sena replikeringen av denna region av kromosomen en konsekvens av dess närhet till telomeren. Dessutom är det känt att "tysta" gener replikeras i slutet av S-fasen, till exempel HML- och HMR-loci, som inte uttrycks i vissa celltyper och är lokaliserade i subtelomera regioner. Aktivt uttryckta gener, såsom MAT-lokuset, tvärtom, replikerar i den första hälften av S-fasen.

Kapitel 3 Initiera replikering

Ursprung för replikering är den plats från vilken replikeringsgaffeln börjar sin rörelse. Men DNA-polymeraser kan inte påbörja replikationsprocessen utan hjälp av andra proteiner. Proteiner som är involverade i igenkännandet av ursprunget och hjälper till att attrahera primaset - RNA-polymeras som syntetiserar primern, "fröet" för DNA-syntes - och DNA-polymeras bildar.

3.1 Replikationsinitiering i E. coli

Initieringen av replikation i oriC i in vitro-systemet börjar med bildandet av ett komplex som inkluderar sex proteiner: DnaA, DnaB, DnaC, HU, Girase och SSB. Först binder DnaA-monomeren till den nio-ledade sekvensen, sedan bildar 20–40 monomerer av detta protein ett stort aggregat. Ursprungsets DNA omger den, och DNA-strängarna separeras i regionen av tre trettonledade sekvenser. I nästa steg förenar DnaB/DpaC-dimeren oriC/DnaA-komplexet och bildar ett aggregat med en storlek på cirka 480 kDa, motsvarande en sfär med en radie på 6 nm. Som ett resultat bildas en replikeringsgaffel.

3.2. Replikationsinitiering i eukaryoter

Initieringen av eukaryot DNA-replikation börjar med bildandet av ett komplex av replikationsursprunget och replikationsinitiatorproteinet. Detta komplex kallas postreplicative (post.-RC). Den fungerar som en plattform för att montera strukturer över hög order, som försätter kromatin i ett tillstånd som är kompetent för replikering. De successiva stadierna av bildning av replikationsinitieringskomplex visas i fig. 1-1. 7.

Initiatorn av DNA-replikation i eukaryota celler är ORC (origin recognition complex), som först beskrevs i S. cerevisiae. Därefter upptäcktes och studerades ORC-liknande proteiner i andra representanter för eukaryoter, såväl som hos däggdjur och människor. I alla eukaryoter bildas ORC av sex subenheter, Orcl-Orc6 (120-50 kDa). Alla sex subenheter i komplexet är väsentliga för den vitala aktiviteten hos S. cerevisiae. Två olika grupper av ORC-subenheter är involverade i igenkännandet av sekvenserna för ursprunget när det binder till replikationsursprunget. Ogc1, Ogc2 och Ogc4 interagerar med ACS, de återstående tre subenheterna känner igen B1-liknande element. Det är möjligt att endast Orc5 binder till B1-nukleotidsekvenser. ORC binder specifikt till DNA endast i närvaro av ATP och har ATPas-aktivitet, som regleras av proteinets koordinerade interaktion med ATP- och ARS-element. ATP binder till Orc1-subenheten och spelar rollen som en kofaktor som är nödvändig för fästningen av ORC till ursprunget. Den specifika ursprungssekvensen bunden till ORC hämmar ATPas-aktiviteten hos Orcl, medan enkelsträngade DNA-regioner som uppträder i S-fas reaktiverar den. Samtidigt ändras ORC-konformationen från förlängd (förlängd) till böjd (böjd). Det är möjligt att bindningen och hydrolysen av ATP av Orcl-subenheten är involverad i kontrollen av ORC-funktioner i cellcykeln.

I fissionsjästen S. mombe innehåller Orc4-proteinet så kallade ”AT-krokar” i den N-terminala domänen, med hjälp av vilka ORC binder till flera regioner av ARS1 rika på AT-sekvenser. Hos S. cerevisiae fäster ORS till ursprunget i slutet av mitosen och bildar ett postreplikationskomplex (post-RC) och förblir associerat med det i efterföljande cellcykler. Samtidigt existerar post-RC i S-, G2- och M-faserna, och i G1-fasen är det en del av det pre-replikativa komplexet (pre-RC).

Det prereplikativa komplexet bildas på basis av post-RC; denna process börjar i alla origo samtidigt vid gränsen för M- och G1-faserna och slutar i slutet av G1 i origo som aktiveras först vid övergången till S-fasen . I origo som aktiveras senare i S-fasen fullbordas bildandet av pro-RC i S-fasperioden som motsvarar var och en av dem. I G1-fasen under sammansättningen av pro-RC kan ORC interagera med cyklinberoende kinaser (Cdks, cyklinberoende kinaser). Denna interaktion är en av de mekanismer som gör att cellen kan bilda pro-RC efter mitos. Cdc6-proteinet (celldelningscykelprotein) och familjen med sex Mst 2–7-proteiner (minkromosomunderhållsproteiner) är de första som går med efter RC vid M/G1-fasgränsen. Mst 2–7-proteinerna är de mest kända i familjen av "mini-kromosomunderhåll"-proteiner som först identifierades i S. cerevisiae i studien av mutanter oförmögna att upprätthålla stabiliteten hos minikromosomer.

Ris. 7. Schema för replikationsinitiering i eukaryoter

Cdc6- och Mst 2-7-proteinerna har beskrivits i många representanter för eukaryoter, inklusive däggdjur. Det har nyligen visat sig att celler S.rotbe och högre eukaryoter, ett annat protein, Cdt1 (celldelningsterminering), är involverat i det tidiga skedet av pro-RC-bildning. Mst 2–7-proteinerna bildar det hexameriska MSM-komplexet, nyckelkomponenten i pro-RC. MSM genererar en kontrollsignal på icke-replikerad kromatin för att hämma för tidig mitos i G1-fasen. Det är också nödvändigt att flytta cellen genom cykeln till S-fasen. Bindning av MSM till replikationsursprunget regleras av fosforylering-defosforylering av individuella subenheter av detta komplex. Till exempel främjar partiell defosforylering av Mst4-subenheten hyperfosforylerad i M-fasen bildningen av pro-RC, medan fullständig defosforylering av Mst3-subenheten inaktiverar komplexet och förhindrar dess bindning till kromatin. Samtidigt beror bindningen av MSM till ursprunget på Cdc6- och Cdt1-proteinerna, som gemensamt "implanterar" MSM på kromatin. I frånvaro av CD6-celler S. cerevisiae förlorar förmågan att initiera DNA-replikation och genomgår "trunkerad" mitos och oreplikerade kromosomer segregerar slumpmässigt till spindelpolerna.

Förmågan hos Cdc6 att förhindra "trunkerad" mitos tills fullbordandet av DNA-replikationen tillhandahålls av dess interaktion med Cdks. Aktiviteten av Cdc6 i G1-fasen regleras också av dess interaktion med ATP, eftersom mutationer i de konserverade sekvenserna av det ATP-bindande Cdc6-motivet ledde till förlusten av kromatinets förmåga att fästa MCM i celler. S. cerevisiae och till undertryckandet av DNA-replikation i mänskliga celler. På S. cerevisiae ett annat protein, Mcm10, som är associerat med kromatin och interagerar med komponenterna i Mst2-7, är involverat i bindningen av MCM till pro-RC. En sådan komplex kontroll av MSM-bindning till ursprunget indikerar att cellen har ett flerstegssystem av regulatoriska mekanismer som är nödvändiga för att förhindra upprepad mitos i närvaro av oreplicerat kromatin. Bindning av MSM till replikationsursprung är nödvändig för att säkerställa genomets stabilitet; det är denna bindning som sätter kromatin i ett tillstånd som kallas replikationsliscenserande. För keyenopus kräver MCM-bindning ytterligare en faktor med samma namn, RLF-B (herlication licensing factor B). MCM-proteiner visar affinitet för histoner snarare än DNA, vilket resulterar i slutet av G1-fasen, hela prereplikationskomplexet är fast fäst vid kromatin direkt vid eller nära replikationsursprunget.

I G1-fasen förenar Cdc7-kinaset med dess regulatoriska subenhet Dbf4 (DNA-bindande faktor 4) den delvis bildade pro-RC, och i den sena G1-fasen eller vid G1/S-fasgränsen, Cdc45-proteinet och det enkelsträngade DNA-bindande replikativt protein A (RPA, replikationsprotein A). Interaktionen mellan Cdc45 och Dbf4/Cdc7 i den sena G1-fasen krävs för efterföljande "påslagning" av replikering i ursprung efter pro-RC-montering.

Dbf4/Cdc7-kinaset binder till eller en tid innan det börjar utföra sina funktioner. Efter att ha gått med i pro-RC "väntar" Dbf4/Cdc7-kinaset på aktivering av Cdk, och först efter det fosforylerar det sina substrat. Rollen för "tidig" bindning av detta kinas till ori förblir oklar.

Bindningen av Cdc45 till kromatin beror på Cdc6- och Mst2-proteinerna och på aktiviteten hos Dbf4/Cdc7-kinaset och cyklinberoende S-fas-kinaser (Cdk-S-fas - Cdc28/Ckb5.6 i jäst och Cdk2/Cuclins A ,E i högre eukaryoter). Cdc45-proteinet kan fosforyleras av Dbf4/Cdc7-kinaset, men detta inträffar först efter aktivering av Cdk-S-fasen. Cdk-S-aktiviteten regleras i sin tur av Sic1-hämmaren, som genomgår ubiquitin-beroende proteolys i slutet av G1-fasen. Bindning av Cdc45-proteinet till pro-RC sker i den sena G1-fasen av cellcykeln endast på ursprunget till de replikoner som startar DNA-syntes först under övergången till S-fasen. Cdk-S och Dbf4/Cdc7-beroende bindning av Cdc45 till andra ursprung utförs vid en specifik tidpunkt för var och en av dem under hela S-fasen. Den troliga mekanismen för Cdc45-bindning till pro-RC är följande: Dbf4/Cdc7, bunden till alla replikationsursprung i G1-fasen, efter exponering för Cdk-S, fosforylerar Mst2 i varje ursprung under den perioden av S-fasen, vilket är bestäms individuellt för varje ursprung. Som ett resultat av Mst2-fosforylering ändras konformationen av MCM-komplexet på ett sådant sätt att det förvärvar förmågan att binda Cdc45. Samtidigt fäster RPA-proteinet till pro-RC. Liksom Cdc45 binder RPA till Cdk-S-ursprunget på ett beroende sätt med deltagande av Mst2. Fästningen av Cdc45- och RPA-proteinerna fullbordar pro-RC-sammansättningen. Omedelbart efter att monteringen av pro-RC är avslutad sker dess partiella dissociation, åtföljd av början av bildandet av RC (replikationskomplex). Cdc6-proteinet är det första som dissocierar från pro-RC under övergången från G1-fasen till S eller ännu tidigare, genomgår fosforylering under verkan av Cdks, följt av ubiquitination och nedbrytning. Denna Cdc6-inaktiveringsväg har visats både för lägre eukaryoter och för vissa representanter för högre eukaryoter. I mänskliga celler förblir nivån av Cdc6 konstant under hela cellcykeln. Men under övergången till S-fasen transporteras Cdc6 från kärnan till cytoplasman. Tydligen regleras denna process också av Cdks. Avlägsnande av Cdc6p från kärnan (genom hydrolys eller transport till cytoplasman) är en av mekanismerna som förhindrar flera replikationshändelser under en cellcykel.

Cdt1-proteinet inaktiveras också efter fullbordande av pro-RC-bildning. Samtidigt, i cellerna i lägre eukaryoter Cdt1. det uttrycks periodiskt, ackumuleras i kärnorna i G1-fasen, och i G2-fasen sjunker dess nivå. I högre eukaryoter kontrolleras Cdt1-aktiviteten av inhibitorproteinet geminin, som saknas i celler i G1-fasen, ackumuleras under S- och G2-faserna, och delvis under M-fasen, och försvinner i M-fasen vid metafas–anafas. gräns.

Till skillnad från Cdc6 och Cdt1 förblir Mst2-7-, RPA- och Cdc45-proteinerna, som har dissocierats från pro-RC, associerade med kromatin i S-fasen under DNA-syntes. Den snabba frisättningen av MCM från pte-RC i jästceller medieras av interaktionen mellan Mcm10 och Mst7. Separationen av MSM och Mst10 underlättas av Cdc45-proteinet.

Mst4,6,7-subenheterna i MSM-komplexet har helikasaktivitet, som visar sig endast vid stimulering under verkan av Cdk-S och Dbf4/Cdc7-kinas. Mst2-7-proteiner är väsentliga inte bara för initiering utan också för förlängningsfasen av replikation, för framskridandet av replikationsgafflar. MSM är en del av RC och är involverad i avvecklingen av dubbelsträngat DNA i replikationsgafflar. I mänskliga celler utförs bindningen av MCM till ursprunget under RC-bildning med deltagande av Mcm10-proteinet, som ackumuleras och bildar ett komplex med kromatin i S-fasen, i motsats till Mcm10 S. seguevisiae. Under övergången av celler från G2-fasen till M, hyperfosforylerar Mcm10 och dissocierar från kromatin, och vid M/G1-fasgränsen genomgår den proteolys genom proteasommekanismen. Sålunda nedreglerar Mcm10-fosforylering och proteolys i mänskliga celler MSM-aktivitet efter fullbordad DNA-replikation. Dessutom kan negativ reglering av MSM-aktivitet härröra från direkt fosforylering av individuella komponenter i detta komplex i sig. Till exempel leder fosforylering av Cdk-specifika Mcm4-ställen i M-fasen till en förlust av helikasaktivitet av Mst4,6,7 och en hög koncentration av Cdk-cyklin E-komplexet i embryonens kärnor Heporus förhindrar bindning av Mst3 till DNA och förhindrar således återassociering av MSM med kromatin efter att replikeringen är avslutad. MCM-komplexet är inte bara involverat i de tidiga stadierna av replikationsinitiering under övergången av celler till G1-fasen, utan också i fullbordandet av denna process i S-fasens komponenter i bildandet av RC. Därför är flera mekanismer för reglering av MSM-aktivitet ganska förståeliga. Om dessa mekanismer i G1-fasen syftar till att främja celler till S-fasen utan upprepad mitos, förhindrar de i S- och G2-faserna replikering av redan replikerat kromatin.

RPA är ett protein som binder enkelsträngat DNA, och dess närvaro i RC vid initiering av replikation är nödvändig för att stabilisera den otvinnade DNA-regionen. RPA bildas av tre subenheter med molekylvikter på 70, 34 och 11 kDa, där 70 kDa-subenheten har enkelsträngad DNA-bindande aktivitet, medan 34 kDa-subenheten är regulatorisk. Den senare fosforyleras av Cdk, vilket verkar vara nödvändigt för aktivering av DNA-replikation. En detaljerad beskrivning av detta komplex kommer att ges nedan.

Cdc45-proteinet är också involverat i bildandet av RC. Är det nödvändigt för DNA-polymeras att fästa? till replikationsursprung. Det har visats att det humana Cdc45-proteinet binder till det humana Mst7-proteinet och p70-subenheten av DNA-polymeras? in vitro. Cdc45 fäster DNA-polymeras? till RC via bindning till Mst7. I jästceller S. cerevisiae Cdc45 fäster DNA-polymeras? till kromatin med deltagande av Mst2.

En av komponenterna i komplexet som utlöser DNA-replikation är DNA-polymeras?. Av alla de många eukaryota DNA-polymeraserna är det hon som innehåller primasaktiviteten, som kan syntetisera ett kort RNA-"frö" - en primer från ribonukleosidtrifosfater. RNA-primern genererar en signal som är en av triggarna för replikation. DNA-polymeras? finns i alla studerade eukaryoter och väl studerade. En detaljerad beskrivning av detta enzym kommer att ges i nästa avsnitt. Det har visats att ett av sätten att reglera initieringen av replikation är associerat med fosforylering av två stora subenheter av DNA-polymeras? under påverkan av CDK. Samtidigt stimulerar cyklin E och Cdk initieringen av replikation under övergången av cellen till S-fasen, medan cyklin A och Cdk hämmar den i G2-fasen.

Uppenbarligen är aktiveringen av de "tidiga och sena aktiva" ursprungen som nämns ovan S. cerevisiae beror på Dbf4/Cdc7p kinaset. Det är troligt att varje ursprung är lokalt reglerat av ytterligare proteinkinaser, såsom Rad53. Kinase Rad53 blockerar lanseringen av "senaktiva" ursprung i den tidiga S-fasen. När denna blockering tas bort aktiverar Dbf4/Cdc7p-kinaset MSM, vilket leder till flera konsekvenser samtidigt: stimulering av MSM-helikasaktivitet och bindning av RPA-proteinet och DNA-polymeras? med ursprung för replikation. Fastsättning av DNA-polymeras? till RC, DNA avveckling i ursprunget och RNA-primersyntes fullbordar initieringen av eukaryot DNA-replikation. Det bör noteras att rollen av DNA-polymeras? begränsad till början av DNA-replikation. Detta DNA-polymeras är inte kapabelt till processiv, det vill säga utökad, DNA-syntes och har inte korrigerande aktivitet. Därför, senare i replikationsprocessen, lägger den till cirka 20 nukleotider till RNA-primern och ersätts av DNA-polymeraser? eller?.

Post-RC, med vars bildande hela kedjan av händelser av DNA-börjar, genomgår förändringar i S-fasen av cellcykeln. Dessa förändringar hänför sig till ORC:s affinitet för DNA. Till exempel Orc1-proteinet Kheporis bildar ett starkt komplex med kromatin i tidig interfas tills sammansättningen av pro-RC är klar. Sedan, i S-fasen, minskar affiniteten hos Orc1 för DNA. Hos däggdjur dissocierar Orc1 från kromatin i S-fasen, förvandlas till en mono- eller di-ubiquitinerad form, deubiquitineras sedan och återbinder till DNA under övergången från M- till G-1-fasen. O2-proteinet, å andra sidan,

förblir associerad med kromatin under hela cellcykeln och är inte ett substrat för ubiquitination. I mänskliga celler i S-fasen dissocierar ett komplex av proteiner som innehåller Orc1 och Orc2 från kromatin, som återassocieras i slutet av mitosen. I jästceller S.rotbe ORC genomgår post-translationella förändringar i cellcykeln: i S-fasen börjar fosforyleringen av en av dess underenheter, Orc2, som når ett maximum i faserna G2 och M. Således, i eukaryota celler, en av mekanismerna som förhindrar replikering av redan replikerat kromatin associeras med -RC antingen genom dissociation av Orc1 från det (i högre eukaryoter) eller genom fosforylering av Orc2 (i lägre eukaryoter).

Tabell 2

Transkriptionsinitieringskomplex i eukaryoter

För att underlätta förståelsen av bindningssekvensen för olika proteiner vid replikationsursprunget, se Tabell 2.

Under de senaste åren har betydande framsteg gjorts för att förstå mekanismerna för reglering av nästan varje steg av replikationsinitiering. De utförs på funktionsnivån för alla komponenter som bildar post-, pre- och replikativa komplex. Dessa komponenter påverkas inte av en utan ett antal olika faktorer. Ett exempel på detta är regleringen av MSM-komplexet, vars aktivitet direkt beror på Cdc6-, Mst10-, Cdt1-proteinerna, cyklinberoende kinaser, Dbf4/Cdc7-kinaser och fosfataser. Regelbundenheterna i processen för initiering av DNA-replikation i embryogenes och de faktorer som påverkar dessa processer är fortfarande dåligt förstådda.

kapitel 4

4.1. Syntes av primer för polymerasreaktion

DNA-polymeraser kan inte starta DNA-syntes direkt på mallen, utan kan bara lägga till nya deoxiribonukleotidenheter till 3-tumsänden av en befintlig polynukleotidkedja. En sådan förbildad kedja som nukleotider tillsätts kallas en primer (eller primer), den består av RNA Kort RNA-primer syntetiseras från ribonukleosidtrifosfater av ett enzym som kallas DNA-primas. Primasaktivitet kan tillhöra antingen ett enskilt enzym eller en av underenheterna av DNA-polymeras. Primas binder till helikas och DNA och bildar en struktur som kallas primosom, och syntetiserar en RNA-primer.RNA-primrar förlängs genom verkan av DNA-polymeras III i prokaryoter och av DNA-polymeras A i eukaryoter. Schematiskt visas denna process på en eftersläpande sträng i Fig. 8. E coli primers syntetiseras av ett speciellt separat enzym - primas.

Ris. 8. RNA-primrar på den eftersläpande strängen

4.2. Konceptet med RNA-DNA-duplex

DNA finns vanligtvis i en cell i B-form. Dessutom beskrivs ytterligare två möjliga former av DNA-tillståndet, A och Z. Dessa former visas i fig. 9. Interaktionen mellan baser i B-formen visas i fig. tio.

I A-formen bildar basplanen en vinkel på 20 grader med vinkelrät mot helixens axel (i B-formen - 0), avståndet mellan basparen minskar till 0,29 nm (i B-formen - 0,34 nm), antalet par per varv ökar till 11 -12 (i B-form - 10).

Baspar i A-formen flyttas mycket kraftigt bort från helixaxeln till molekylens periferi - nästan halva radien; skiftet når 4–5 Å, och i B-formen av DNA är det nära noll.

Ris. 9. Möjliga former av DNA

Under bildandet av en primer (processen för dess syntes kommer att presenteras mer i detalj när man beskriver eukaryot DNA-polymeras), bildas en DNA-RNA-duplex, som finns i A-form. Så

Sålunda, i A-formen av duplexet, tillhandahålls en optimal balans mellan de hydrofoba och komplementära interaktionerna mellan baserna av mallen och primern.

Ris. tio. Ömsesidigt arrangemang nukleotider i DNA i B-form

4.3. Nyckelenzymer involverade i DNA-syntes

Många av de nu kända detaljerna i DNA-replikationsprocessen har etablerats tack vare studiet av beteendet och aktiviteten hos enzymerna som säkerställer driften av replikationsapparaten. Mekanismen för bakteriell DNA-replikation, särskilt DNA E coli och bakteriofager som förökar sig i den. Ganska välkända är enzymerna för replikering av jäst, Drosophila, däggdjur.

4.3.1. DNA-polymeras

DNA-subimsrazaser finns i alla prokaryota och eukaryota celler. Dessutom inducerar många bakterie- och djurvirus bildandet av virusspecifika DNA-polymeraser eller proteiner som underlättar det effektiva deltagandet av värdcells-DNA-polymeraser i viral DNA-replikation.

Många prokaryota och eukaryota DNA-polymeraser har isolerats i ren form, och deras fysikaliska och enzymatiska egenskaper har karakteriserats i detalj. Och även om dessa egenskaper inte är exakt identiska, är katalysmekanismen för alla dessa enzymer i i generella termer det samma.

Ris. 11. Den allmänna principen för strukturen av DNA-polymeraser.

Den primära strukturen av eukaryota DNA-polymeraser innehåller konserverade motiv som är homologa med motsvarande motiv för prokaryota enzymer. Detta bekräftar att alla DNA-syntetiserande enzymer delar en gemensam strukturplan. Den allmänna principen för strukturen av DNA-polymeraser visas i fig. 11. Beroende på formen på DNA-polymeraset kan det liknas vid en halvöppen borste höger hand, där handflatan, tummen och andra fingrar representerar de tre huvudsakliga rumsliga domänerna och bildar en hålighet som håller DNA-mallen och primern under syntes. Konservativa motiv A, B och C bildar ett aktivt centrum i "palm"-domänen, "fingrar" håller den enkelsträngade mallen och "tummen" trycker på primern - den dubbelsträngade mallregionen.

Appliceras på olika typer eukaryota DNA-polymeraser, kan denna modell modifieras. DNA-polymeraser fungerar tillsammans med olika proteinkomplex som håller dem till replikationsgaffeln. Oftast kallas de "clamp" och "clamp loader" ("sliding clamp", "clamp loader").

Efter att ha kombinerat DNA-polymeraset med klämman, flyttar "clamp loader" sig bort från reaktionsstället men förblir nära den eftersläpande strängen för att laddas vid den nya primer-mallfusionsplatsen när DNA-polymeraset har dissocierat vid slutförandet av syntesen av det föregående Okazaki-fragmentet. Denna process visas schematiskt i fig. 12. Dessa komplex i eukaryoter och deras roll i replikering kommer att diskuteras mer i detalj nedan.

4.3.1.1. Prokaryota DNA-polymeraser

Prokaryota polymeraser betecknas med romerska siffror (i motsats till eukaryota polymeraser, som betecknas med grekiska bokstäver). DNA-polymeras I (Pol 1) har studerats mest omfattande. E coli. Det är en enda polypeptid med multifunktionella aktiviteter. Som ett DNA-polymeras katalyserar Po11 överföringen av 5'-deoxinukleotidylenheter av deoxinukleosid-5'-trifosfater till 3'-OH-gruppen i DNA- eller RNA-kedjan, varefter den överförda basen paras med motsvarande bas av den komplementära DNA-kedjan. För polymerisation behöver enzymet således en primer som en deoxinukleotidacceptor och en mall som bestämmer tillsatsen av den önskade nukleotiden. Förutom polymerisationen av nukleotider, katalyserar Po11 två andra reaktioner, biologisk roll vilket är väldigt viktigt. I en av dem sker hydrolys av fosfodiesterbindningar i en DNA-sträng eller i den oparade änden av duplex-DNA, och en nukleotid avlägsnas i en akt, med början från 3'-änden av kedjan. ( 3"-5"-exonukleas). Den andra reaktionen består också i klyvning av nukleotider, men hydrolysen startar från 5'-änden av det dubbelsträngade DNA:t mot 3'-änden (5'-3'-exonukleas). Dessa olika aktiviteter är inneboende i olika platser i PolI-polypeptidkedjan.Om PolI behandlas med trypsin in vitro delas polypeptidkedjan i stora och små fragment. Det stora, C-terminala fragmentet ("Klenow-fragmentet") bibehåller DNA-polymeras- och 3"-5" exonukleasaktiviteter; det lilla N-terminala fragmentet har endast 5'-3'-exonukleasaktivitet.

Roll I och dess inneboende exonukleasaktiviteter spelar en mycket viktig roll i replikeringen och reparationen av kromosomalt DNA. E coli. 3'-5"-exonukleasaktivitet ger kontroll över fästningen av varje nukleotid och avlägsnandet av felaktiga nukleotider i den nyligen syntetiserade kedjan. Om denna aktivitet undertrycks som ett resultat av vissa mutationer i genen som kodar för PolI, inträffar ofta mutationer under genomreplikation - bassubstitutioner.

DNA-polymerasets förmåga att förlänga 3"-änden av strängen parad med matrissträngen gör att den kan fylla i luckorna mellan segmenten av den eftersläpande strängen. PolI förlänger Okazaki-fragmenten från 3"-ändarna och tar bort primerribonukleotiderna från vilka 5"-ändarna av intilliggande fragment börjar, vilket är en nödvändig förutsättning för bildandet av en kontinuerlig eftersläpande sträng. Eftersom PolI kan förlänga 3"-änden av en av strängarna vid brytningen i dubbelsträngat DNA och avlägsna nukleotider från 5" slutet av samma paus (en process som kallas nick translation ), detta enzym spelar en nyckelroll i reparationen av skadat DNA. Nick-translation används i stor utsträckning in vitro för syntes av radiomärkt DNA.

På E coli det finns två andra DNA-polymeraser, men de finns i cellen i mindre mängder. PolII fäster nukleotider mycket mindre effektivt än Poll och har inte 5'-3'-exonukleasaktivitet. Därför kan PolII fylla i luckorna mellan DNA-fragment parade med mallsträngen, men kan inte klyva RNA-nukleotider från Okazaki-fragment eller utföra nick-translation. Roll av roll II i replikering och underhåll av kromosomalt DNA E coli hittills är oklart. Förmodligen kan det vara inblandat i återställandet av DNA-syntes efter skada och stopp av replikationsgaffeln. Denna process kallas resyntes.

PolIII holoenzym är nyckelenzymet som är ansvarigt för kromosomal DNA-replikation E coli. Varje cell innehåller endast 10–20 kopior av PolIII, ett holoenzym, men det är den som är huvudkomponenten i multienzympolymeraskomplexet som initierar bildningen av replikationsgafflar vid replikationsursprunget, deltar i förlängningen av den ledande strängen i gaffel, och förlänger RNA-primrar med bildandet av Okazaki-fragment. Eftersom PolIII, ett holoenzym, inte har 5'-3'-exonukleasaktivitet, kräver replikering av den eftersläpande strängen deltagande av PolI för att produkten som bildas med deltagande av PolIII ska förlängas och RNA-primrarna tas bort vid 5'-änden av Okazaki-fragmenten.

Riktad mutationsanalys avslöjade förändringar i polypeptidkedjan av huvudenzymet (kärnan) PolIII, och studerade aminosyrasubstitutioner som gör det möjligt att tillskriva vissa typer av enzymatisk aktivitet till specifika subenheter i enzymkomplexet. Således har a-subenheten polymerasaktivitet, medan a-subenheten har 3'5'-exonukleasaktivitet. Emellertid har komplexet av a- och a-subenheter en signifikant högre polymeras- och exonukleasaktivitet än var och en av de motsvarande subenheterna separat. Funktionen för den tredje, β-subenheten, är fortfarande oklar.

Utöver subenheterna som utgör PolIII-kärnan, innehåller PolIII-holoenzyme ytterligare sju subenheter: ?,?,?,?,?',?, och?. De uppräknade polypegiderna finns också i många exemplar, så som ett resultat säger de. massan av polymeraskomplexet är ungefär 103 kDa. P-subenhetens roll är att minimera risken för att enzymet separerar från mallen innan kopieringsprocessen är klar, dvs den fungerar som en "klämma". Underenhet? är en dimeriseringsfaktor av replikativa holoenzymer. Den exakta funktionen hos de andra underenheterna är okänd. Det är fullt möjligt att PolIII-holoenzym existerar i två former, som var och en innehåller en viss uppsättning hjälpsubenheter som ger enzymet vissa egenskaper. I en form katalyserar enzymet syntesen av en kontinuerlig ledande sträng och i den andra en diskontinuerlig eftersläpande.

PolIII-holoenzym katalyserar samma syntesreaktioner som PolI, men fungerar ungefär 60 gånger snabbare. Dessutom har PolIII-holoenzym en ökad affinitet för mallen och ger högre kopieringseffektivitet. PolIII-holoenzymet kan också binda till andra proteiner, vilket ökar effektiviteten i kopieringsprocessen genom att koordinera några av de viktiga enzymatiska stegen i replikationen. Mer om detta hög nivå Organisationer i komplexen kan inkludera proteiner som lindar upp DNA-helixen vid replikationsursprung och replikationsgafflar (helikaser), initierar bildningen av primer-RNA (primaser), säkerställer sekventiell förlängning av DNA-kedjor, avslutar replikationsprocessen och separerar dotter-DNA-helixar.

DNA-polymeraser som syntetiseras av andra bakterier och många bakteriofager skiljer sig åt i sin fysiska struktur och egenskaper. Men reaktionerna de katalyserar är nästan identiska med de som studeras i E coli. Alla DNA-polymeraser har ett korrigerande 3'-5'-exonukleas, men de flesta enzymer har inte ett 5'-3'-exonukleas. Till exempel kan T4-fag-DNA-polymeras utföra 3'-5'-exonukleasreaktionen och korrigera replikationsfel, men kan inte katalysera 5'-3'-exonukleasreaktionen och kan därför inte ge nick-translation. I T4-fag-DNA-replikation katalyserar ett annat fagkodat protein 5'-3'-exonukleasreaktionen för att avlägsna RNA-primrar innan Okazaki-fragmenten kombineras. I processen med intermittent syntes av eftersläpande strängar och reparation av DNA-skada i T4-fag, fungerar detta enzym tillsammans med fag-DNA-polymeras. Vissa djurvirus (t.ex. herpesvirus, vacciniavirus och hepatitvirus) inducerar syntesen av specifika polymeraser för att replikera deras genom.

Andra virus bildar proteiner som stimulerar cellulära DNA-replikationssystem eller deltar i viral DNA-replikation. Till exempel syntetiserar papovavirus de proteiner som är nödvändiga för att initiera replikation. Humana adenovirus kodar för proteiner som "utlöser" initieringen av syntesen av båda strängarna av linjärt viralt DNA. De producerar också speciella DNA-bindande proteiner som underlättar replikering.

4.3.1.2. eukaryota DNA-polymeraser

Många DNA-polymeraser har identifierats i eukaryota celler, men deras fysikaliska och funktionella egenskaper har studerats i mindre detalj än motsvarande prokaryota enzymer.

Tabell 3

eukaryota DNA-polymeraser

Den exakta rumsliga strukturen som bestäms genom röntgendiffraktionsanalys är endast känd för ett eukaryotiskt DNA-polymeras, polymeraset av β-typ, som skiljer sig markant i struktur från andra eukaryota DNA-polymeraser. En sammanfattning av de viktigaste eukaryota polymeraserna visas i tabell 3.

4.3.1.3. DNA-polymeras? – primas

I eukaryota celler sker DNA-syntes huvudsakligen i specifika täta strukturer ("replikationsfabriker") fästa till en diffus kärnmatris. Det antas att fosfolipider spelar en viss roll i den molekylära organisationen av kärnmatrisen och att DNA är associerat med kärnskelettet genom hydrofoba interaktioner. "Replikationsfabriker" eller 21S-replikationskomplex inkluderar en grupp enzymer som består av minst 30 proteiner med en molekylvikt på 15 till 300 kDa och innehåller förutom DNA-polymeras? - primaser även 3 "-5"-exonukleas, DNA-ligas I, RNas H, DNA-topoisomeras I, DNA-helikas, PCNA och ett antal andra faktorer. Detta komplex innehåller också RPA, som specifikt interagerar med p48-subenheten i polymeras-primaskomplexet. En betydande tillgång på DNA-polymeras? ackumuleras i äggen från tagghudingar, amfibier, benfiskar och Drosophila för att säkerställa intensiv nukleär DNA-replikation under tidig utveckling.

Typiskt DNA-polymeras? har inte korrektor 3"-5"-exonukleasaktivitet. Men i den 182 kDa katalytiska subenheten av DNA-polymeras? Drosophila, ett 3'-5'-exonukleas hittades, som är aktivt endast vid dissociering av 73 kDa-subenheten.

Multiprotein form av DNA-polymeras? innehåller även ett protein som binder dinukleotiden diadenosintetrafosfat (Ap 4 A). Det antas att Ap4A är involverad i DNA-replikation och celldelning. Finns det några data om förmågan hos DNA-polymeras? använd Ap 4 A som primer. Emellertid är deltagandet av Ap4A som en primer in vivo osannolikt, snarare används den som en effektor. Intressant nog är tryptofanyl-tRNA-syntetas, som syntetiserar denna dinukleotid, lokaliserat i samma multiproteinkomplex.

Vanligtvis ett primas-polymeraskomplex? består av fyra subenheter: en stor subenhet med en molekylvikt på 180 kDa, eller en familj av polypeptider med storlekar från 140 till 160 kDa; subenheter med en molekylvikt på cirka 68–70 kDa och två små subenheter med molekylvikter på 54–58 och 46–50 kDa. p180-subenheten är ansvarig för polymerasfunktionen. Primasaktivitet är associerad med två små subenheter. I detta fall är 48 kDa-subenheten katalytisk och utför direkt DNA-priming, medan 58 kDa-subenheten är involverad i bindningen av den initierande purinnukleotiden och fästningen av p48-subenheten till DNA-polymeras?. Det påverkar också polymerisationshastigheten och stabiliteten hos produkten som syntetiseras av 48 kDa-subenheten. p58 underlättar också inträdet av p48 från cytoplasman in i kärnan. p180-subenheten interagerar direkt med p58.

Subenheten på 68–70 kDa är associerad med den katalytiska subenheten och krävs för transporten av den katalytiska polypeptiden in i cellkärnan. Är subenheten på 68–70 kDa också involverad i regleringen av DNA-polymerasnivåer? i cellen stimulerar det syntesen av den katalytiska polypeptiden. Även om DNA-polymeras?-primaskomplexet består av fyra subenheter, kan den kvantitativa sammansättningen av detta komplex vara annorlunda. Möjligen polymeras? och primas finns i "barken" i förhållandet 1:3.

4.3.1.4. Priming reaktion

Initieringen av replikation och diskontinuerlig DNA-syntes på den eftersläpande strängen sker enligt RNA-primermekanismen och är en universell egenskap för DNA-replikation i pro- och eukaryoter.

DNA-primas skiljer sig från andra RNA-polymeraser i ett antal av dess unika egenskaper. Först matris- och substratspecificitet. För det andra, ovanlig processivitet - syntesen av multimerer som är multiplar av 10-nukleotidlänkar. För det tredje låg noggrannhet och resistens mot vissa hämmare av RNA- och DNA-polymeraser. Här är det nödvändigt att återvända till problemet med syntesen av RNA-primrar. Syntesen av RNA-primrar på naturliga mallar börjar på flera, men inte slumpmässiga, platser; dess initiering sker med ATP eller GTP även vid höga koncentrationer av CTP och UTP. Det har visats att till exempel DNA från SV40-viruset innehåller föredragna initieringsställen, 3'-dCTTT eller 3'-dCCC, belägna inom regioner med 7-25 pyrimidinnukleotider. Ett högt ATP/GTP-förhållande ökar sannolikheten för initiering i 3'-dCTTT-regionerna och ett lågt i 3'-dCCC-regionerna. Koncentrationen av NTP och nukleotidsekvensen för mallen bestämmer således initieringsställena. In vivo initieringsställen skiljer sig emellertid markant från initieringsställena som används under SV40 DNA-replikation. I många fall hittades sekvensen 5'-YYYYYYYYCTTTYYYY-3', där Y = C eller T, som är startrampen för att initiera syntesen av DNA-primas som en del av ett komplex med DNA-polymeras?. Den minsta längden på pyrimidinklustret måste vara minst 7 nt. Substitution av en av pyrimidinerna vid 3'-änden av klustret minskar avsevärt initieringsfrekvensen, medan substitutioner inuti och utanför klustret leder till en förskjutning i utgångspunkten Det är känt att DNA-primasen själv känner igen mallen. ).

Detta komplex har en annan specifik funktion: syntesen av den telomera eftersläpande DNA-strängen hos däggdjur utförs av DNA-polymeras-a-primas.

DNA-primas är ett relativt långsamt enzym. Den genomsnittliga hastigheten för NTP-inkorporering av detta enzym är ungefär två storleksordningar lägre än hastigheten för dNTP-inkorporering av DNA-polymeras?. DNA-polymeras? kan förlänga primers längre än 7-10 nt. Produkter 2–6 bp långa. är inte substrat av DNA-polymeras? och kallas abortiv, Innan syntesen av RNA-primern, DNA-polymeras? och DNA-primas agerar självständigt, och efter det samordnas deras aktiviteter. Den syntetiserade RNA-primern rör sig in i polymerasets aktiva centrum utan dissociation till lösning. Denna intramolekylära rörelse av primern i duplex med mallen är snabb och jämförbar i hastighet med primersyntes. Efter DNA-polymeras? förlänger primern, primas börjar syntesen av en ny primer och cykeln upprepas. Eukaryot DNA-primas skiljer sig från andra RNA-polymeraser i sin förmåga att inkorporera en deoxiribonukleotid i en primer, och prokaryotisk primas har samma egenskap. En av de möjliga förklaringarna till behovet av att inkludera dNTP i 3'-änden av primern är behovet av en övergång från A-formen till B-formen av DNA. Därför förstår man mekanismen för "växling" av DNA-polymeras?-primaskomplex från RNA-syntes till DNA är mycket viktigt. stor betydelse. Primas förmåga att samtidigt känna igen både ribo- och deoxiribotrifosfater är av allvarligt vetenskapligt intresse.

Valet av RNA-primer bestäms av den hydrofoba naturen hos protein-nukleinsyrainteraktioner. I fallet med en RNA-DNA-hybrid är duplexet i A-form, vilket ger en optimal balans mellan de hydrofoba och komplementära interaktionerna mellan baserna av mallen och primern.

Efter initiering åtföljs primertillväxt av extraktion av mallbaser från proteinets hydrofoba hålighet för parning med baserna i den växande RNA-strängen. Under sådana konkurrensförhållanden dissocierar korta di- och trinukleotider lätt och bildar abortiva produkter. När primerlängden ökar, ökar styrkan hos duplexen, påverkan av hydrofobiciteten hos det aktiva stället försvagas och basparen närmar sig helixaxeln. Med en primerlängd på 7 n skapas förutsättningar för inkludering av en deoxinukleotid och övergång till en energimässigt gynnsammare B-form. Här är det nödvändigt att ta hänsyn till den större affiniteten för enzymet dNTR jämfört med NTP. Det föreslagna konceptet är uppenbarligen av universell karaktär, eftersom detta även sker under transkriptionsinitiering.

DNA-polymeras? binder först mallen, sedan primern och substratet. DNA-polymeras? är mest aktiv på dubbelsträngat DNA som innehåller gap som inte är mindre än 20–30 nt långa. Matrisbindande region med DNA-polymeras? är ganska lång. Den skyddar starkt mot hydrolys av 9 n primersträngen, 13 nt dubbelsträngad region och 14 nt enkelsträngsmallen och skyddar svagt några baser utanför denna region. Enzymet binder till 19–20 n-matrisen via joniska och hydrofoba interaktioner, bindningseffektiviteten i detta fall korrelerar med hydrofobiciteten hos matrisbaserna.

Vad är kännetecknet för DNA-polymeras? är dess förmåga att förlänga RNA-primrar och stark association med DNA-primers, som syntetiserar dessa primrar.

Genomsnittlig processivitet för DNA-polymeras? är 20–50 n. Primase gör sällan ett misstag i ögonblicket för dinukleotidsyntes, men använder då lätt fel NTP. Även om hastigheten för inkorporering av felaktiga nukleotider beror på nukleotidsekvensen för mallen och själva den felaktiga nukleotiden, är i princip DNA-primas det mest oprecisa nukleotidpolymeriserande enzymet. I vissa fall är en felaktig nukleotid mindre än 100 korrekt. Införandet av en felaktig nukleotid förhindrar inte införandet av nästa korrekta nukleotid. Primas kan polymerisera liknande nukleotider och generera primrar med flera fel som inte hämmar ytterligare syntes och, efter intramolekylär överföring till det aktiva DNA-polymeraset, förlängs av DNA-polymeras i närvaro av dNTP.

Det finns två modeller av mekanismen för syntes av primers som inte är komplementära till mallen. Enligt den första modellen inkluderar enzymet helt enkelt nukleotider som inte är komplementära till mallen. Den andra modellen involverar införandet av en nukleotid som är komplementär till mallen, följt av glidning av primern i förhållande till mallen. Den låga noggrannheten hos DNA-primas utgjorde grunden för hypotesen om varför RNA är primern i DNA-replikation. Eftersom de första nukleotiderna felaktigt kan inkluderas i den nya växande strängen, antas det att RNA-primern markerar det "mycket missvisande" stället för efterföljande excision och mer exakt uppbyggnad. Denna synpunkt verkar övertygande, men förmodligen är huvudorsaken till utseendet av RNA-primern fortfarande associerad med en mer effektiv initiering av DNA-syntes i närvaro av A-formen av RNA-DNA-duplexet.

Till skillnad från primas, DNA-polymeras? är ett ganska exakt enzym. Hon gör i genomsnitt 1/30 000 till 1/50 000 fel. En viktig roll för att säkerställa syntesens specificitet spelas av proteinreplikationsfaktorer. I närvaro av RPA, exaktheten av DNA-polymeras? stiger. Det är känt att skillnaden mellan de fria energierna för bildandet av korrekta och felaktiga baspar i polymerasets aktiva centrum är uppenbarligen 10 gånger större än i ett vattenhaltigt medium.

Högmolekylära former av DNA-polymeras isolerade från celler? kan ha andra aktiviteter än DNA-polymeras och primas. Dessa komplex är fragment av den replikativa maskinen av celler. I komplexet som replikerar den ledande strängen, DNA-polymeras? associerad med DNA-polymeras?, och i komplexet som syntetiserar den fördröjda strängen, med DNA-polymeras?. I eukaryoter är båda komplexen troligen anslutna till varandra i replikationsgaffeln, liknande hur holoenzymer för syntesen av de ledande och eftersläpande strängarna är kopplade i prokaryoter. Detta bevisas av isoleringen från mänskliga celler av komplex som kallas synteser och som innehåller DNA-polymeraser?,? och?, såväl som ett antal andra replikativa proteiner, inklusive DNA-primas, replikationsfaktor RFC, PCNA, poly(ADP-ribos)-polymeras och DNA-ligas I. Från detta högmolekylära komplex, DNA-helikas A med molekylvikt 90 kDa och 5" -> 3"-exonukleas med en mol. väger 47 kDa. Med DNA-polymeras? P1-proteinet från musceller, som är en homolog till jäst-MC3-proteinet, kan också bindas. DNA-polymeras?-primaskomplexet dissocierar under meios.

Det stora T-antigenet hos SV40 (och andra papovavirus) interagerar med p180- och p70-subenheterna i DNA-polymeras?-primaskomplexet och rekryterar detta komplex till ori virus. Under papillomavirusreplikation, DNA-polymeras? associerad med viralt helikas El.

Nedregleringen av komplexet i cellcykeln beror inte bara på pl80-fosforylering, utan också på p68-subenhetsfosforylering av cyklinA-beroende kinaser. I jästceller är DNA-polymeras?-primaskomplexet associerat med kromatin i G1- och S-faserna i cellcykeln, men inte G2/M. Kromatinbindning beror på defosforylering av 86 kDa-subenheten (p70-homolog) i slutet av mitosen.

4.3.1.5. DNA-polymeras? och?

DNA-polymeras? är en heterodimer som består av en katalytisk subenhet med en molekylmassa på 125–130 kDa och en subenhet på 48–55 kDa, som är nödvändig för att binda till processivitetsfaktorn för prolifererande cellkärnantigen (PCNA). Den lilla subenheten behövs för att enzymet ska övervinna strukturella barriärer i naturliga enkelsträngade matriser. Faktum är att det nativa enzymet kan vara en tetramer som innehåller två subenheter med molekylvikter på 125 och 55 kDa, och 55 kDa subenheten är en dimeriseringsfaktor för replikativa holoenzymer, som subenheten? i DNA-polymeras III E coli. I frånvaro av PCNA, DNA-polymeras? har låg processivitet på långa enkelsträngade matriser, och i närvaro av PCNA ökar processiviteten med 10-100 gånger. Med hjälp av deletionsmutanter fann man att i DNA-polymeras? möss för PCNA-bindning är ansvariga för de 129-149 aminosyraresterna i den N-terminala regionen av den katalytiska polypeptiden, den C-terminala domänen är mindre konserverad och innehåller två DNA-bindningsställen.

DNA-polymeras holoenzym? inkluderar processivitetsfaktorn PCNA och faktorerna RFC (replikationsfaktor C) och RPA, den är sammansatt på primer-matriskomplexet i följande ordning: först binder RFC till 3'-OH-änden av primern på en enkel- strängad DNA-mall "täckt" med RPA-proteinet Sedan, i närvaro av ATP, bildar RFC på DNA-duplexet intill 3'-änden av primern en ringstruktur av tre PCNA-molekyler med en molmassa på 36 kDa vardera, och PCNA säkerställer vidhäftningen av DNA-polymeras? till 3'-änden av primern, vilket fullbordar bildningen av ett mycket processivt holoenzym.

I själva PCNA har ställen som är ansvariga för bindning till RFC-subenheter och DNA-polymeraser identifierats. Förutom DNA vid polymeraset? aminosyraresterna 121–135 är involverade och bildar en loop mellan PCNA-domänerna.

3"->5"-exonukleasaktivitet hos DNA-polymeras? regleras också av de faktorer som utgör holoenzymet. I frånvaro av hjälpfaktorer, 3'->5'-exonukleasaktivitet av DNA-polymeras? är låg, men i närvaro av RPA-protein, såväl som DNA-polymeras?, ökar den med 8-10 gånger. Den aktiverande effekten av RPA på 3'->5'-exonukleasaktivitet beror tydligen på destabiliseringen av frö-matriskomplexet i närvaro av detta proteinkomplex.

DNA-polymerassyntes? i cellcykeln regleras på nivån av transkription. Mängden mRNA för enzymet och proteinet når sitt maximum vid G1/S-fasgränsen. Dynamik för DNA-polymerassyntes? i cykeln motsvarar dynamiken hos DNA-polymeras?. Intressant nog korrelerar syntesen av PCNA under cellcykeln med syntesen av DNA-polymeras? Men innehållet av PCNA ökar stadigt och förblir högt upp till G2/M-fasgränsen. DNA-polymeras? är ett fosfoprotein, vars högsta grad av fosforylering tillhör fasen S. Fosforylering av den katalytiska subenheten av 125 kDa DNA-polymeras? Det utförs tydligen av det cyklinberoende proteinkinaset cdk2, specifikt för G1-fasen. Intressant nog påverkar fosforylering av den katalytiska subenheten inte dess enzymatiska aktivitet.

DNA-polymeras? human innehåller två polypeptider - katalytiska 261 kDa och 55 kDa. DNA-polymeras? jäst består av fem subenheter: katalytisk 256 kDa och subenheter 80, 34, 31 och 29 kDa. Subenhet av 80 kD DNA-polymeras? jäst är en homolog av 55 kDa-subenheten av enzymet från däggdjursceller. De enzymatiska aktiviteterna, DNA-polymeras och 3'->5' exonukleas, är associerade med en polypeptid med hög molekylvikt, vars N-terminala domän tillhandahåller båda aktiviteterna och den C-terminala domänen krävs för att kontrollera inträdet i cellen in i cykelns S-fas.

En egenskap hos DNA-polymeras holoenzym? är dess lägre beroende av hjälpfaktorerna PCNA, RFC och RPA jämfört med holoenzymet av DNA-polymeras?. DNA-polymeras? kapabel att processivt förlänga fröet på enkelsträngsmatriser i frånvaro av PCNA. I närvaro av en komplett uppsättning replikationsfaktorer ökar syntesens processivitet och effektiviteten av DNA-polymerasbindning? med primers. Det finns en idé att på DNA-mallar belagda med RPA-proteinet bildar faktorerna PCNA, RFC och ATP ett "igenkänningskomplex av 3'-OH-änden av primern." Har DNA-polymerasets bindningsställe i PCNA-molekylen inte sammanfaller med DNA-polymerasets bindningsställe? Detta bevisas av det faktum att olika mutanta former av PCNA-proteinet syntetiserat av stammarna rspa-79 och rspa-90 inte kan interagera med DNA-polymeraserna α respektive β. polymeras?, och i rspa-90-mutanten, DNA-polymeras?.

En annan skillnad mellan DNA-polymeras holoenzymer? och? ligger i de olika hastigheterna för DNA-syntes. Under optimala förhållanden, hastigheten för DNA-syntes av DNA-polymeraset holoenzym? ungefär en storleksordning lägre än synteshastigheten för DNA-polymeras? av holoenzymet. Denna skillnad beror på DNA-polymerasernas olika funktion i replikationsgaffeln. Ett DNA-polymeras-holoenzym? utför snabb och processiv syntes av den ledande strängen, använder för förlängning den enda primern som syntetiseras i ori-regionen, och dissocierar först när den når slutet av replikonet, och flera holoenzymer av DNA-polymeras? kan samtidigt syntetisera Okazaki-fragment i Okazaki-zonen genom att förlänga primrarna som syntetiseras av DNA-polymeras?-primas i början av varje fragment. I detta fall bör en snabb omsättning av DNA-polymeras β ske, åtföljd av dissociation efter slutförandet av syntesen av fragmentet och association med primern för nästa fragment. Vid syntesen av eftersläpande strängfragment, när primerkoncentrationen är hög och flera fragment kan syntetiseras samtidigt, är polymerisationshastigheten mindre viktig än förmågan att snabbt byta från ett Okazaki-fragment till ett annat.

DNA-polymeras, ? och?, har 3'->5'-exonukleasaktivitet, som utför en korrigerande funktion under DNA-syntes, men felfrekvenserna i syntesen av de ledande och eftersläpande strängarna skiljer sig åt. Detta beror på det faktum att en del av den eftersläpande strängens DNA syntetiseras av DNA-polymeras?, som kan syntetisera DNA med stor kvantitet fel.

4.3.1.6. DNA-polymeras?

Detta polymeras är lokaliserat i mitokondrier och dess funktion är associerad med mtDNA-replikation och reparation. DNA-polymeraser är heterodimerer som består av en stor katalytisk subenhet på 125–140 kDa, som har DNA-polymeras och 3'->5'-exonukleasaktivitet, och en hjälpsubenhet på 35–50 kDa, vars funktion är okänd. Liksom andra mtDNA-replikationsenzymer, DNA-polymeras kodas av kärngenomet Den primära strukturen för DNA-polymeras liknar den för DNA-polymeras I E coli, speciellt i regionen för de katalytiska centran, i den N-terminala 3'->5'-exonukleasdomänen och den C-terminala polymerasdomänen.

Slut på gratis provperiod.