ठोस पोषक तत्व मीडिया (कोच प्लेट विधि) पर बीजारोपण द्वारा कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण। आर. कोच के कार्य और सूक्ष्म जीव विज्ञान और संक्रामक रोगविज्ञान के लिए उनका महत्व एरोबेस सूक्ष्म जीव विज्ञान की शुद्ध संस्कृति का अलगाव

माइक्रोबायोलॉजी, वायरोलॉजी और इम्यूनोलॉजी के विकास में मुख्य चरण

इनमें निम्नलिखित शामिल हैं:

1.अनुभवजन्य ज्ञान(सूक्ष्मदर्शी के आविष्कार और सूक्ष्म जगत के अध्ययन के लिए उनके उपयोग से पहले)।

जे. फ्रैकास्टोरो (1546) ने संक्रामक रोगों के एजेंटों की जीवित प्रकृति का सुझाव दिया - कॉन्टैगियम विवम।

2.रूपात्मक काललगभग दो सौ वर्ष लगे।

1675 में एंटोनी वैन लीउवेनहॉक सबसे पहले 1683 में प्रोटोजोआ का वर्णन किया गया - बैक्टीरिया के मुख्य रूप। उपकरणों की अपूर्णता (X300 सूक्ष्मदर्शी का अधिकतम आवर्धन) और माइक्रोवर्ल्ड का अध्ययन करने के तरीकों ने सूक्ष्मजीवों के बारे में वैज्ञानिक ज्ञान के तेजी से संचय में योगदान नहीं दिया।

3.शारीरिक काल(1875 से) - एल. पाश्चर और आर. कोच का युग।

एल पाश्चर - किण्वन और क्षय प्रक्रियाओं की सूक्ष्मजीवविज्ञानी नींव का अध्ययन, औद्योगिक सूक्ष्म जीव विज्ञान का विकास, प्रकृति में पदार्थों के संचलन में सूक्ष्मजीवों की भूमिका की व्याख्या, खोज अवायवीयसूक्ष्मजीव, सिद्धांतों का विकास सड़न रोकनेवाला,तरीकों नसबंदी,कमजोर करना ( क्षीणन)डाहऔर प्राप्त करना टीके (वैक्सीन उपभेद)।

आर कोच - अलगाव विधि शुद्ध संस्कृतियाँठोस पोषक माध्यम पर, एनिलिन रंगों से जीवाणुओं को रंगने की विधियाँ, एंथ्रेक्स, हैजा के प्रेरक एजेंटों की खोज ( कोच अल्पविराम), तपेदिक (कोच चिपक जाता है),माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकी में सुधार. हेनले मानदंड की प्रायोगिक पुष्टि, जिसे हेनले-कोच अभिधारणा (त्रय) के रूप में जाना जाता है।

4.इम्यूनोलॉजिकल अवधि.

एमिल रॉक्स की आलंकारिक परिभाषा के अनुसार आई.आई. मेचनिकोव "सूक्ष्मजीव विज्ञान के कवि" हैं। उन्होंने सूक्ष्म जीव विज्ञान में एक नए युग का निर्माण किया - प्रतिरक्षा (प्रतिरक्षा) का सिद्धांत, फागोसाइटोसिस के सिद्धांत को विकसित किया और प्रतिरक्षा के सेलुलर सिद्धांत को प्रमाणित किया।

उसी समय, शरीर में उत्पादन पर डेटा जमा किया गया था एंटीबॉडीबैक्टीरिया और उनके खिलाफ विषाक्त पदार्थ,जिसने पी. एर्लिच को प्रतिरक्षा के हास्य सिद्धांत को विकसित करने की अनुमति दी। फागोसाइटिक और ह्यूमरल सिद्धांतों के समर्थकों के बीच बाद की दीर्घकालिक और उपयोगी चर्चा में, प्रतिरक्षा के कई तंत्र सामने आए और विज्ञान का जन्म हुआ इम्मुनोलोगि.

बाद में यह पाया गया कि वंशानुगत और अर्जित प्रतिरक्षा पांच मुख्य प्रणालियों की समन्वित गतिविधि पर निर्भर करती है: मैक्रोफेज, पूरक, टी- और बी-लिम्फोसाइट्स, इंटरफेरॉन, मुख्य हिस्टोकोम्पैटिबिलिटी प्रणाली, जो प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के विभिन्न रूप प्रदान करती है। 1908 में आई.आई. मेचनिकोव और पी. एर्लिच। नोबेल पुरस्कार प्रदान किया गया।

12 फरवरी, 1892 रूसी विज्ञान अकादमी की एक बैठक में, डी.आई. इवानोव्स्की ने बताया कि तंबाकू मोज़ेक रोग का प्रेरक एजेंट एक फ़िल्टर करने योग्य वायरस है। इस तिथि को जन्मदिन माना जा सकता है वाइरालजी, और डी.आई इवानोव्स्की इसके संस्थापक हैं। इसके बाद, यह पता चला कि वायरस न केवल पौधों में, बल्कि मनुष्यों, जानवरों और यहां तक ​​कि बैक्टीरिया में भी बीमारियों का कारण बनते हैं। हालाँकि, जीन की प्रकृति और आनुवंशिक कोड स्थापित होने के बाद ही वायरस को जीवित प्रकृति के रूप में वर्गीकृत किया गया था।

5. सूक्ष्म जीव विज्ञान के विकास में अगला महत्वपूर्ण चरण था एंटीबायोटिक्स की खोज. 1929 में ए. फ्लेमिंग ने पेनिसिलिन की खोज की और एंटीबायोटिक चिकित्सा का युग शुरू हुआ, जिससे चिकित्सा में क्रांतिकारी प्रगति हुई। बाद में यह पता चला कि रोगाणु एंटीबायोटिक दवाओं के प्रति अनुकूलित हो जाते हैं, और दवा प्रतिरोध के तंत्र के अध्ययन से दूसरे की खोज हुई एक्स्ट्राक्रोमोसोमल (प्लास्मिड) जीनोमबैक्टीरिया.

पढ़ना प्लाज्मिड्सदिखाया कि वे वायरस से भी अधिक सरल रूप से संरचित जीव हैं, और इसके विपरीत अक्तेरिओफगेसबैक्टीरिया को नुकसान न पहुँचाएँ, बल्कि उन्हें अतिरिक्त जैविक गुण प्रदान करें। प्लास्मिड की खोज ने जीवन के अस्तित्व के रूपों और इसके विकास के संभावित रास्तों की समझ में काफी विस्तार किया है।

6. आधुनिक आणविक आनुवंशिक चरणआनुवंशिकी और आणविक जीव विज्ञान की उपलब्धियों और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप के निर्माण के संबंध में 20 वीं शताब्दी के उत्तरार्ध में माइक्रोबायोलॉजी, वायरोलॉजी और इम्यूनोलॉजी का विकास शुरू हुआ।

बैक्टीरिया पर प्रयोगों ने वंशानुगत विशेषताओं के संचरण में डीएनए की भूमिका को साबित कर दिया है। आणविक जीव विज्ञान और आनुवंशिक अनुसंधान की वस्तुओं के रूप में बैक्टीरिया, वायरस और बाद में प्लास्मिड के उपयोग से जीवन में अंतर्निहित मूलभूत प्रक्रियाओं की गहरी समझ पैदा हुई है। जीवाणु डीएनए में आनुवंशिक जानकारी को एन्कोड करने के सिद्धांतों के स्पष्टीकरण और आनुवंशिक कोड की सार्वभौमिकता स्थापित करने से अधिक उच्च संगठित जीवों की विशेषता वाले आणविक आनुवंशिक पैटर्न को बेहतर ढंग से समझना संभव हो गया है।

एस्चेरिचिया कोली के जीनोम को डिकोड करने से जीन को डिजाइन करना और प्रत्यारोपण करना संभव हो गया है। अब तक जेनेटिक इंजीनियरिंगनई दिशाएं बनाईं जैव प्रौद्योगिकी.

कई वायरस के आणविक आनुवंशिक संगठन और कोशिकाओं के साथ उनकी बातचीत के तंत्र को समझ लिया गया है, एक संवेदनशील कोशिका के जीनोम में एकीकृत होने के लिए वायरल डीएनए की क्षमता और वायरल कार्सिनोजेनेसिस के बुनियादी तंत्र स्थापित किए गए हैं।

इम्यूनोलॉजी में एक वास्तविक क्रांति आई है, जो संक्रामक इम्यूनोलॉजी के दायरे से कहीं आगे निकल गई है और सबसे महत्वपूर्ण मौलिक चिकित्सा और जैविक विषयों में से एक बन गई है। आज तक, इम्यूनोलॉजी एक ऐसा विज्ञान है जो न केवल संक्रमणों से सुरक्षा का अध्ययन करता है। आधुनिक अर्थ में इम्यूनोलॉजी एक विज्ञान है जो शरीर की संरचनात्मक और कार्यात्मक अखंडता को बनाए रखते हुए, आनुवंशिक रूप से विदेशी हर चीज से शरीर की आत्मरक्षा के तंत्र का अध्ययन करता है।

इम्यूनोलॉजी में वर्तमान में कई विशिष्ट क्षेत्र शामिल हैं, जिनमें से, संक्रामक इम्यूनोलॉजी के साथ, सबसे महत्वपूर्ण में इम्यूनोजेनेटिक्स, इम्यूनोमॉर्फोलॉजी, ट्रांसप्लांटेशन इम्यूनोलॉजी, इम्यूनोपैथोलॉजी, इम्यूनोहेमेटोलॉजी, ऑन्कोइम्यूनोलॉजी, ओटोजेनेसिस इम्यूनोलॉजी, वैक्सीनोलॉजी और एप्लाइड इम्यूनोडायग्नोस्टिक्स शामिल हैं।

माइक्रोबायोलॉजी और वायरोलॉजी जैसे बुनियादी जैविक विज्ञानअपने स्वयं के लक्ष्यों और उद्देश्यों के साथ कई स्वतंत्र वैज्ञानिक विषयों को भी शामिल करें: सामान्य, तकनीकी (औद्योगिक), कृषि, पशु चिकित्सा और उच्चतम मूल्यमानवता के लिए मेडिकल माइक्रोबायोलॉजी और वायरोलॉजी।

मेडिकल माइक्रोबायोलॉजी और वायरोलॉजी मानव संक्रामक रोगों (उनकी आकृति विज्ञान, शरीर विज्ञान, पारिस्थितिकी, जैविक और आनुवंशिक विशेषताओं) के प्रेरक एजेंटों का अध्ययन करती है, उनकी खेती और पहचान के लिए तरीके विकसित करती है, उनके निदान, उपचार और रोकथाम के लिए विशिष्ट तरीके विकसित करती है।

बैक्टीरिया की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए कोच विधि का उपयोग किया जाता है। उचित तनुकरण से परीक्षण सामग्री का 1 मिलीलीटर एक खाली बाँझ पेट्री डिश में डाला जाता है और 10 - 15 मिलीलीटर पिघला हुआ और 45 0 सी एमपीए तक ठंडा किया जाता है, तरल के साथ मिलाया जाता है, डिश को टेबल की सतह पर घुमाया जाता है।

फसल उगाने के बाद आगर की सतह और गहराई में उगी कालोनियों की गिनती की जाती है। ऐसा करने के लिए, कप को काली पृष्ठभूमि पर उल्टा रखा जाता है, प्रत्येक गिनती की गई कॉलोनी को कांच पर एक मार्कर से चिह्नित किया जाता है। केवल उन्हीं प्लेटों का मूल्यांकन किया गया जिन पर 30 से 300 कॉलोनियाँ विकसित हुईं। यदि एक प्लेट पर 300 से अधिक कॉलोनियां विकसित हो गई हैं, और विश्लेषण दोहराया नहीं जा सकता है, तो एक आवर्धक कांच और ग्रिड के साथ एक विशेष प्लेट का उपयोग करके मजबूत पार्श्व रोशनी के तहत कॉलोनियों को गिना जा सकता है।

कालोनियों की संख्या प्लेट पर विभिन्न स्थानों पर 1 सेमी 2 क्षेत्रफल वाले कम से कम 20 वर्गों में गिनी जाती है। प्रति 1 सेमी2 में कॉलोनियों की औसत संख्या की गणना की जाती है और डिश के क्षेत्रफल से गुणा किया जाता है।

कालोनियों की गिनती करते समय, एक विशेष जीवाणु गिनती उपकरण, पीएसबी, का उपयोग किया जा सकता है।

प्रत्येक डिश में कालोनियों की गिनती का परिणाम प्रति 1 मिलीलीटर (सेमी 3) या परीक्षण सामग्री के 1 ग्राम में बैक्टीरिया की संख्या है, जो तनुकरण को ध्यान में रखता है। जीवाणुओं की अंतिम संख्या को दो आसन्न तनुकरणों के साथ टीकाकृत प्लेटों पर कालोनियों की गिनती के परिणामों के अंकगणितीय माध्य के रूप में लिया जाता है।

उदाहरण:तनुकरण 10 -1 - 250 कॉलोनियाँ, तनुकरण 10 -2 - 23 कॉलोनियाँ।

कुल बैक्टीरिया गिनती = 250 x 10 + 23 x 100/2 = 2400 सीएफयू/एमएल = 2.4 x 10 2 सीएफयू/एमएल (कॉलोनी बनाने वाली इकाइयां प्रति एमएल)।

शोध परिणाम को 2 - 3 महत्वपूर्ण अंकों तक पूर्णांकित किया जा सकता है।

अनुमापन विधि.

एसपीएम की संख्या निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है।

पहला चरण:सामग्री का समरूपीकरण. यदि आवश्यक हो, तो सूक्ष्मजीवों को तरल चरण में स्थानांतरित करने के लिए एक निलंबन तैयार करें।

दूसरा चरण:तनुकरणों की एक श्रृंखला तैयार करना।

तीसरा चरण:परीक्षण सामग्री की चयनित मात्रा (100, 10, 1 मिली) बोना और 1 मिली को तरल पोषक माध्यम में पतला करना। विधि की सटीकता बढ़ाने के लिए, प्रत्येक मात्रा को पोषक माध्यम के कई हिस्सों (दो-, तीन-, पांच-पंक्ति बुवाई) में समानांतर में टीका लगाया जा सकता है। इष्टतम तीन गुना पुनरावृत्ति (अपेक्षाकृत कम लागत पर पर्याप्त विश्वसनीयता) है।

चौथा चरण:तरल पोषक माध्यम पर विकास की उपस्थिति और सकारात्मक मात्रा से ठोस पोषक माध्यम पर बुआई को ध्यान में रखते हुए।

5वां चरण:ठोस पोषक माध्यम पर विकसित सूक्ष्मजीवों की पहचान। इस मामले में, सांस्कृतिक गुणों को ध्यान में रखा जाता है और, यदि आवश्यक हो, तो अतिरिक्त अध्ययन किए जाते हैं (टिनक्टोरियल, रूपात्मक, जैव रासायनिक और सीरोलॉजिकल गुणों का अध्ययन)।

यदि एकल-पंक्ति विधि का उपयोग किया जाता है, तो एक नियम के रूप में, परिणाम वांछित सूक्ष्मजीव के अनुमापांक के रूप में व्यक्त किया जाता है, जिसे सबसे छोटी मात्रा (उच्चतम कमजोर पड़ने) के रूप में लिया जाता है जिसमें यह अभी भी पाया गया था।

यदि एक बहु-पंक्ति विधि का उपयोग किया गया था, तो परिणाम विशेष तालिकाओं का उपयोग करके दर्ज किए जाते हैं जो वृद्धि देने वाले सकारात्मक वॉल्यूम के संयोजन के आधार पर टिटर या इंडेक्स (टीएनआई) निर्धारित करना संभव बनाते हैं।

विशेष वातावरण.

जीवाणु विज्ञान में, सूखा पोषक माध्यमऔद्योगिक उत्पादन, जो हीड्रोस्कोपिक पाउडर होते हैं जिनमें पानी को छोड़कर माध्यम के सभी घटक होते हैं। उनकी तैयारी के लिए, सस्ते गैर-खाद्य उत्पादों (मछली अपशिष्ट, मांस और हड्डी का भोजन, तकनीकी कैसिइन) के ट्राइप्टिक डाइजेस्ट का उपयोग किया जाता है। वे परिवहन के लिए सुविधाजनक हैं, लंबे समय तक संग्रहीत किए जा सकते हैं, मीडिया तैयार करने की विशाल प्रक्रिया से प्रयोगशालाओं को राहत देते हैं, और उन्हें मीडिया मानकीकरण के मुद्दे को हल करने के करीब लाते हैं। चिकित्सा उद्योग ड्राई मीडिया एंडो, लेविन, प्लॉस्कीरेव, बिस्मथ सल्फाइट अगर, पोषक तत्व अगर, बीपी संकेतक के साथ कार्बोहाइड्रेट और अन्य का उत्पादन करता है।

ऊष्मातापी

थर्मोस्टैट्स का उपयोग सूक्ष्मजीवों की खेती के लिए किया जाता है।

थर्मोस्टेट एक उपकरण है जो एक स्थिर तापमान बनाए रखता है। उपकरण में एक हीटर, कक्ष, दोहरी दीवारें होती हैं, जिनके बीच हवा या पानी का संचार होता है। तापमान को थर्मोस्टेट द्वारा नियंत्रित किया जाता है। अधिकांश सूक्ष्मजीवों के प्रजनन के लिए इष्टतम तापमान 37°C है।

पाठ 7

विषय: एरोबिक्स की शुद्ध संस्कृति को अलग करने के तरीके। यांत्रिक पृथक्करण विधि द्वारा एरोबिक बैक्टीरिया की शुद्ध संस्कृति के अलगाव के चरण

शिक्षण योजना

1. जीवाणुओं की "शुद्ध संस्कृति" की अवधारणा

2. यांत्रिक पृथक्करण द्वारा शुद्ध संस्कृतियों को अलग करने की विधियाँ

3. शुद्ध संस्कृतियों को अलग करने की जैविक विधियाँ

4. बैक्टीरिया की पहचान के तरीके

पाठ का उद्देश्य:छात्रों को शुद्ध संस्कृतियों को अलग करने के विभिन्न तरीकों से परिचित कराना, लूप, स्ट्रोक और इंजेक्शन के साथ बोना सिखाना

प्रदर्शन के लिए दिशानिर्देश

अपने प्राकृतिक आवास में बैक्टीरिया संघों में पाए जाते हैं। रोगाणुओं के गुणों और रोग प्रक्रिया के विकास में उनकी भूमिका को निर्धारित करने के लिए, सजातीय आबादी (शुद्ध संस्कृतियों) के रूप में बैक्टीरिया का होना आवश्यक है। एक शुद्ध संस्कृति एक पोषक माध्यम पर उगाए गए एक ही प्रजाति के जीवाणु व्यक्तियों का एक संग्रह है।

एरोबिक बैक्टीरिया की शुद्ध संस्कृतियों को अलग करने की विधियाँ

पाश्चर विधि कोच विधि जैविक भौतिक

(ऐतिहासिक है (प्लेट वायरिंग)

अर्थ)

रासायनिक विधि

शुकुकेविच

आधुनिक

लूप से बुआई करें स्पैचुला से बुआई करें

(ड्रिगाल्स्की विधि)

शुद्ध संस्कृतियों को अलग करने की विधियाँ:

1. यांत्रिक पृथक्करण विधियाँ अगर की सतह पर परीक्षण सामग्री की क्रमिक रगड़ द्वारा रोगाणुओं को अलग करने पर आधारित हैं।

ए) पाश्चर की विधि - ऐतिहासिक महत्व है, रोलिंग विधि द्वारा तरल पोषक माध्यम में परीक्षण सामग्री के क्रमिक कमजोर पड़ने का प्रावधान करती है

बी) कोच की विधि - प्लेट विधि - मांस पेप्टोन एगर के साथ परीक्षण सामग्री के अनुक्रमिक कमजोर पड़ने पर आधारित है, इसके बाद पेट्री डिश में पतला सामग्री के साथ टेस्ट ट्यूब डालना होता है।

ग) ड्रिगल्स्की विधि - जब बुआई सामग्री में माइक्रोफ्लोरा प्रचुर मात्रा में बोया जाता है, तो एक स्पैटुला के साथ क्रमिक बुआई के लिए 2-3 कप का उपयोग करें।

घ) समानांतर स्ट्रोक में एक लूप के साथ बुआई करना।

2. जैविक विधियाँ आधारित हैं जैविक गुणरोगज़नक़।

क) जैविक - अत्यधिक संवेदनशील जानवरों का संक्रमण, जहां रोगाणु तेजी से बढ़ते हैं और जमा होते हैं। कुछ मामलों में, यह विधि एकमात्र है जो किसी बीमार व्यक्ति से रोगज़नक़ की संस्कृति को अलग करने की अनुमति देती है (उदाहरण के लिए, टुलारेमिया के साथ), अन्य मामलों में यह अधिक संवेदनशील है (उदाहरण के लिए, सफेद चूहों में न्यूमोकोकस या रोगज़नक़ को अलग करना) गिनी सूअरों में तपेदिक)।

बी) रासायनिक - माइकोबैक्टीरिया के एसिड प्रतिरोध पर आधारित। सामग्री को सहवर्ती वनस्पतियों से मुक्त करने के लिए, यह
अम्लीय घोल से उपचारित किया गया। केवल तपेदिक बेसिली ही विकसित होगी, क्योंकि एसिड-प्रतिरोधी रोगाणु एसिड के प्रभाव में मर गए।

ग) भौतिक विधि गर्मी के प्रति बीजाणुओं के प्रतिरोध पर आधारित है। बीजाणु बनाने वाले जीवाणुओं के कल्चर को अलग करना
मिश्रण, सामग्री को 80°C पर गर्म किया जाता है और पोषक माध्यम पर टीका लगाया जाता है। केवल बीजाणु जीवाणु ही विकसित होंगे, क्योंकि उनके बीजाणु जीवित रहे और वृद्धि को जन्म दिया।

डी) शुकुकेविच की विधि - प्रोटियस वल्गेरिस की उच्च गतिशीलता पर आधारित, रेंगने वाली वृद्धि पैदा करने में सक्षम।

प्लेट आगर बनाने की विधि

एमपीए को पानी के स्नान में पिघलाया जाता है, फिर 50-55°C तक ठंडा किया जाता है। बोतल की गर्दन को अल्कोहल लैंप की लौ में जला दिया जाता है, पेट्री डिश खोल दी जाती है ताकि बोतल की गर्दन डिश के किनारों को छुए बिना फिट हो जाए, 10-15 मिलीलीटर एमपीए डाला जाता है, ढक्कन बंद कर दिया जाता है बंद करके, डिश को हिलाया जाता है ताकि माध्यम समान रूप से वितरित हो जाए, और इसे सख्त होने तक क्षैतिज सतह पर छोड़ दिया जाए। सूखने के बाद प्लेट आगर प्लेटों को ठंड में संग्रहित किया जाता है।

लूप बुआई

एक स्टेराइल कूल्ड लूप का उपयोग करके, सामग्री की एक बूंद लें, अपने बाएं हाथ से कप के एक किनारे को खोलें, लूप को अंदर लाएं और विपरीत किनारे पर एक लूप के साथ एक ही स्थान पर कुछ स्ट्रोक बनाएं, फिर लूप को फाड़ दें और टीका लगाएं 5-6 मिमी के अंतराल के साथ कप के एक किनारे से दूसरे तक समानांतर स्ट्रोक में सामग्री। बुआई की शुरुआत में, जब लूप पर बहुत सारे रोगाणु होते हैं, तो वे मिश्रित वृद्धि देंगे, लेकिन प्रत्येक स्ट्रोक के साथ लूप पर कम से कम रोगाणु होते हैं, और वे अकेले रहेंगे और अलग-अलग कालोनियों का निर्माण करेंगे।

ड्रिगल्स्की विधि के अनुसार बुआई करें

इस विधि का उपयोग तब किया जाता है जब माइक्रोफ़्लोरा (मवाद, मल, थूक) से अत्यधिक दूषित सामग्री का टीकाकरण किया जाता है। ड्रिगल्स्की विधि का उपयोग करके बोने के लिए, एक स्पैटुला और कई कप (3-4) लें। स्पैटुला धातु के तार या कांच के डार्ट से बना एक उपकरण है, जो त्रिकोण या एल-आकार में मुड़ा हुआ होता है। सामग्री को पहले कप में एक लूप या पिपेट के साथ डाला जाता है और माध्यम की सतह पर एक स्पैटुला के साथ समान रूप से वितरित किया जाता है, बिना जलाए, सामग्री को दूसरे कप में पोषक माध्यम में रगड़ा जाता है, और फिर तीसरे में. इस तरह की बुआई से, पहले कप में मिश्रित वृद्धि होगी, और बाद के कपों में अलग-अलग कॉलोनियां विकसित होंगी।

बैक्टीरिया को शुद्ध कल्चर के रूप में अलग करने की अपेक्षाकृत कम विधियाँ ज्ञात हैं। यह अक्सर ठोस कल्चर माध्यम पर अलग-अलग कोशिकाओं को अलग करके, स्ट्रीक प्लेटिंग विधि का उपयोग करके, या प्लेटों में थोड़ी मात्रा में तरल कल्चर डालकर किया जाता है ( सीमित तनुकरण विधि). हालाँकि, एक अलग कॉलोनी प्राप्त करना हमेशा संस्कृति की शुद्धता की गारंटी नहीं देता है, क्योंकि कॉलोनियाँ न केवल व्यक्तिगत कोशिकाओं से, बल्कि उनके समूहों से भी विकसित हो सकती हैं। यदि सूक्ष्मजीव बलगम बनाते हैं, तो अक्सर इसमें विदेशी रूप जुड़े होते हैं। शुद्धिकरण के लिए, गैर-चयनात्मक माध्यम (एनएसएम) का उपयोग करना बेहतर होता है, क्योंकि दूषित सूक्ष्मजीव इस पर बेहतर ढंग से विकसित होते हैं और उनका पता लगाना आसान होता है।

एक ठोस पोषक माध्यम पर पृथक कालोनियों को प्राप्त करना या तो एक स्पैटुला के साथ सूक्ष्मजीवों के निलंबन को छानकर प्राप्त किया जाता है ( कोच विधि), या बैक्टीरियोलॉजिकल लूप का उपयोग करना ( थकावट स्ट्रोक विधि). सूक्ष्मजीव कोशिकाओं के यांत्रिक पृथक्करण के परिणामस्वरूप, उनमें से प्रत्येक एक प्रकार के सूक्ष्म जीव की एक पृथक कॉलोनी को जन्म दे सकता है।

स्पैचुला से छानना (कोच विधि)निम्नलिखित अनुक्रम में उत्पादित:

1) संवर्धन संस्कृति की एक बूंद को एक बाँझ पिपेट के साथ डिश नंबर 1 में पोषक माध्यम की सतह पर लगाया जाता है और एक बाँझ स्पैटुला के साथ वितरित किया जाता है;

2) स्पैटुला को बाहर निकालें, कप को तुरंत बंद करें और स्पैटुला को बिना स्टरलाइज़ किए कप नंबर 2 में स्थानांतरित करें। माध्यम की पूरी सतह पर कल्चर के वितरण को स्पैटुला के उसी तरफ से छूकर अनुकरण करें जिसका उपयोग पहले नमूना वितरित करने के लिए किया गया था;

3) बिल्कुल वही क्रियाएं कप नंबर 3 में की जाती हैं, जिसके बाद स्पैटुला को निष्फल कर दिया जाता है;

4) बीज वाले बर्तनों को थर्मोस्टेट में रखा जाता है और इष्टतम तापमान पर इनक्यूबेट किया जाता है।

एक निश्चित समय के बाद, कपों को थर्मोस्टेट से हटा दिया जाता है और सूक्ष्मजीवों की वृद्धि का अध्ययन किया जाता है। आमतौर पर, कप नंबर 1 में बैक्टीरिया की निरंतर वृद्धि देखी जाती है, और बाद के कपों में कॉलोनी देखी जाती है।

लूप छानना (ड्रेनिंग स्ट्रीक विधि)इसमें पेट्री डिश में अगर माध्यम की सतह पर एक संवर्धन संस्कृति से एक बैक्टीरियोलॉजिकल लूप बोना शामिल है। पहले चरण में, कल्चर के साथ एक लूप का उपयोग करके अगर माध्यम पर समानांतर स्ट्रोक की एक श्रृंखला लागू की जाती है (चित्र 4.2, ए). लूप को निष्फल किया जाता है, अगर माध्यम के असंक्रमित हिस्से पर ठंडा किया जाता है और पहले वाले के लंबवत दिशा में स्ट्रोक की एक श्रृंखला बनाई जाती है (चित्रा 4.2, बी). फिर लूप को फिर से स्टरलाइज़ किया जाता है, ठंडा किया जाता है और दिशा में स्ट्रोक लगाया जाता है में(चित्र 4.2), और अगली नसबंदी के बाद - दिशा में जी(चित्र 4.2)। कपों को थर्मोस्टेट में रखा जाता है और एक निश्चित समय के बाद परिणामों को ध्यान में रखा जाता है। आमतौर पर स्ट्रोक्स पर एऔर बीबढ़ता बड़ी संख्याकालोनियाँ (कभी-कभी निरंतर वृद्धि), जबकि धारियों पर मेंऔर जीअलग-अलग कालोनियां बन जाती हैं।

चित्र 4.2 - पृथक कॉलोनी प्राप्त करने के लिए बैक्टीरिया की स्ट्रीक छानने की योजना

ठोस मीडिया में क्रमिक तनुकरण- प्लेटों को बोने की सबसे सरल विधि, जिसमें यह तथ्य शामिल है कि नमूने को बाँझ पिघले और ठंडे अगर के साथ एक टेस्ट ट्यूब में डालने के बाद, माध्यम को मिलाया जाता है, पेट्री डिश में डाला जाता है और सख्त होने दिया जाता है। अच्छी तरह से पृथक कालोनियों को प्राप्त करने के लिए, क्रमिक दस गुना तनुकरण की एक श्रृंखला तैयार करें और 1 मिलीलीटर नमूने सीधे कप में डालें, 15-20 मिलीलीटर पिघला हुआ अगर माध्यम डालें और कप को हिलाकर मिलाएं। कभी-कभी अलग-अलग कॉलोनियां आगर में डूब जाती हैं और उन्हें केवल यंत्रवत् ही हटाया जा सकता है। यह भी बुरा है कि बैक्टीरिया पिघले हुए अगर के तापमान पर कुछ समय वातावरण में बिताते हैं।

यदि, पौधों पर कुछ लक्षणों और सूक्ष्म परीक्षण के परिणामों के आधार पर, यह संदेह है कि रोग का प्रेरक एजेंट एक जीवाणु है, तो अगला कदम इसे अलग करना होना चाहिए।

इस मामले में, यह माना जाता है कि रोगज़नक़ अपने साथ रहने वाले जीवों से दूषित होता है, यानी मिश्रित आबादी होती है। एक अलग बढ़ती कॉलोनी के रूप में रोगज़नक़ प्राप्त करने के लिए, ऊतक मैकरेट को माध्यम पर धारित किया जाना चाहिए।

छूकर बोना. कैलक्लाइंड इनोक्यूलेशन लूप का उपयोग करके, बैक्टीरिया युक्त पौधे के ऊतक मैकरेट की एक छोटी मात्रा लें और, हल्के आंदोलनों के साथ, अगर सतह को नुकसान पहुंचाए बिना, तैयार पोषक माध्यम पर 4-6 स्ट्रोक लगाएं। लूप को फिर से कैल्सिन करने के बाद, माध्यम वाले कप को 90° दाईं ओर घुमाया जाता है और फिर दूसरे स्ट्रोक से 4-6 स्ट्रोक लगाए जाते हैं, सुई को फिर से कैल्सिन किया जाता है और तीसरी बुआई की जाती है। इससे आरंभिक सामग्री का पतलापन इस प्रकार हो जाता है कि बैक्टीरिया, थर्मोस्टेट में 28 डिग्री सेल्सियस पर 48-72 घंटों तक ऊष्मायन के बाद, विभिन्न आकृतियों और रंगों की अलग-अलग कॉलोनियां बनाते हैं। फिर कालोनियों को आगे की जांच के लिए अगर तिरछी ट्यूबों में स्थानांतरित किया जाता है। एक कैलक्लाइंड लूप का उपयोग करके, एक कॉलोनी लें और इसे सांप या ज़िगज़ैग के रूप में सावधानीपूर्वक गति के साथ पोषक तत्व अगर पर लगाएं।

कोच डालने की विधि. कोच प्लेट विधि यह सुनिश्चित करती है कि प्रत्येक कॉलोनी एक ही जीवाणु कोशिका से बनी हो। प्रारंभिक सामग्री से बाँझ पानी में एक निलंबन तैयार करना और केवल इस तनुकरण के साथ कोच विधि का उपयोग करना सबसे अच्छा है। निलंबन की एक छोटी मात्रा को 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा पोषक माध्यम के साथ पहली टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित किया जाता है। फिर ट्यूब की सामग्री को हथेलियों के बीच घुमाकर इनोकुलम के साथ मिलाया जाता है। इसके बाद, एक दूसरी टेस्ट ट्यूब लें, इसे बर्नर की लौ पर ध्यान से खोलें, और पहले टेस्ट ट्यूब से सब्सट्रेट के तीन हिस्सों को इसमें स्थानांतरित करने के लिए बड़े लूप का उपयोग करें। नेक और स्टॉपर को फायर करने के बाद, टेस्ट ट्यूब की सामग्री को पहले पेट्री डिश में डाला जाता है, जिससे डिश का ढक्कन इतना खुल जाता है कि उसके नीचे टेस्ट ट्यूब की नेक डाली जा सके। डालने के तुरंत बाद, कप को बंद कर दें और पोषक माध्यम को सावधानीपूर्वक समान रूप से वितरित करें।

दूसरे टेस्ट ट्यूब की सामग्री को अच्छी तरह से मिश्रित करने के बाद, तीसरा टेस्ट ट्यूब लें और दूसरे से सब्सट्रेट के छह हिस्सों को एक लूप के साथ इसमें स्थानांतरित करें। टेस्ट ट्यूब की सामग्री को एक कप में डाला जाता है, और टेस्ट ट्यूब की सामग्री को मिश्रित करने के बाद कप में डाला जाता है। माध्यम वाले बर्तनों को 28°C पर थर्मोस्टेट में इनक्यूबेट किया जाता है, कुछ दिनों के बाद, प्रारंभिक सामग्री में मौजूद बैक्टीरिया कॉलोनी बनाते हैं;

सिलसिलेवार प्रजनन. यदि, उदाहरण के लिए, मिट्टी से बैक्टीरिया को अलग करना आवश्यक है, तो क्रमिक तनुकरण का उपयोग किया जाता है। बाँझ पोषक माध्यम (15 मिली प्रति कप) को कपों में डाला जाता है, निलंबन के अंतिम तीन तनुकरणों में से 0.1 मिली को कठोर अगर पर लगाया जाता है और एक ग्लास स्पैटुला के साथ सतह पर फैलाया जाता है।

बैक्टीरिया को अलग करने के लिए, 1 ग्राम मिट्टी को 9 मिलीलीटर पानी में निलंबित कर दिया जाता है, अच्छी तरह से हिलाया जाता है, कुछ सेकंड के लिए व्यवस्थित होने दिया जाता है, और निलंबन से सिलसिलेवार पतलापन तैयार किया जाता है। इस विधि का उपयोग करके प्रत्येक नमूने में सूक्ष्मजीवों की संख्या निर्धारित की जा सकती है।

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