Fermentinių reakcijų kinetika. Fermentinių reakcijų greičio priklausomybė nuo substratų, fermentų koncentracijos, temperatūros Kokia yra fermentinės reakcijos tvarka pagal fermentą
Fermentinių reakcijų greitis priklauso nuo sub-
sluoksnis Ši priklausomybė yra kompleksinė, kuri tam tikriems fermentams apibūdinama paraboline kreive (29 pav.).
29 pav. – Fermentinės reakcijos greičio priklausomybė
dėl substrato koncentracijos
Parabolinis priklausomybės pobūdis paaiškinamas tuo, kad fermentui sąveikaujant su substratu susidaro fermento-substrato kompleksas. Iš pradžių didėjant substrato koncentracijai, didėja fermentų-substratų kompleksų koncentracija reakcijos mišinyje, o tai pasireiškia lygiagrečiu reakcijos greičio padidėjimu. Esant tam tikrai substrato koncentracijai (prisotinimui), įvyksta savotiškas visų aktyvių fermentų molekulių centrų „prisotinimas“ reakcijos mišinyje. Fermentinės reakcijos greitis esant sočiai koncentracijai tampa didžiausias. Toliau didėjant substrato kiekiui reakcijos mišinyje, jis nesikeičia.
Iš fermentinės reakcijos greičio priklausomybės nuo substrato koncentracijos grafiko apskaičiuojami du svarbūs rodikliai:
1. Maksimalus reakcijos greitis (V maks.). Jis apibrėžiamas kaip reakcijos greitis esant prisotintam substrato koncentracijai. Didžiausia greičio vertė atspindi fermento katalizinę galią. Didesni fermentai V max yra galingesni katalizatoriai. Jie katalizuoja didesnio skaičiaus substrato molekulių transformaciją per laiko vienetą. Didžiausias greitis išreiškiamas fermento apsisukimų skaičiumi. Apyvartos skaičius apskaičiuojamas pagal substrato molekulių, kurias fermentas paverčia per laiko vienetą (s -1), skaičių. Daugumos fermentų apyvartos skaičius yra 10 4. Tuo pačiu metu yra fermentų, kuriems greitisžymiai daugiau (600 000 karbanhidrazei) arba mažiau nei ši vertė (100 chimotripsino).
2. Michaelis pastovus (KAM m). Michaelio konstanta yra substrato koncentracija, kuriai esant reakcijos greitis yra pusė didžiausio. Didumas KAM m atspindi fermento afinitetą substratui. Kuo didesnė ši vertė, tuo mažesnis fermento afinitetas substratui. KAM m išreiškiamas substrato moliais. Taigi, vertė KAM m, palyginti su gliukoze, gliukokinazės fermentui yra 10 mmol, o heksokinazei - 0,01 mmol. Heksokinazė turi didesnį afinitetą gliukozei nei gliukokinazė, esant tokiai pačiai substrato koncentracijai, ji greičiau katalizuoja gliukozės fosforilinimą.
Remdamiesi fermentinės reakcijos greičio priklausomybės nuo substrato koncentracijos kreivės matematine analize, L. Michaelis ir M. Menten (1913) išvedė formulę, leidžiančią įvertinti ryšį tarp reakcijos greičio, t. didžiausia norma ir Michaelio konstanta. Šiuo metu ji apibrėžiama kaip Michaelis-Menten lygtis.
V o = V max [ S]/K m + [ S],
Kur V o – reakcijos greitis, S– substrato koncentracija.
Bendrosios fermentų savybės
Nepaisant tam tikrų struktūros, funkcijų ir tarpląstelinės lokalizacijos skirtumų, fermentai pasižymi daugybe bendrų savybių. Tai apima jų katalizinio aktyvumo pasireiškimo priklausomybę nuo temperatūros (terminio labilumo) ir aplinkos pH, taip pat substrato specifiškumą.
Būdinga fermentų savybė yra termolabilumas. Šį reiškinį galima iliustruoti fermentinės reakcijos greičio ir reakcijos mišinio temperatūros grafiku (30 pav.).
30 pav. – Fermentinės reakcijos greičio priklausomybė nuo temperatūros
reakcijos terpė ( t opt – optimali temperatūra; V- greita reakcija)
Kaip matyti iš pateikto grafiko, esant artimai 4 o C temperatūrai, fermentinės reakcijos praktiškai nevyksta. Dėl šios priežasties, prieš atliekant biocheminius tyrimus, biologinius objektus galima tam tikrą laiką laikyti šaltyje. Būtent šaltis leidžia maisto produktams išsaugoti nuo autolizės (savaiminio virškinimo).
Padidėjus temperatūrai, didėja fermentinės reakcijos greitis. To priežastis yra substrato ir fermentų molekulių kinetinės energijos padidėjimas, dėl kurio padidėja jų sąveikos greitis. Panašus reiškinys stebimas iki temperatūros, kuri atitinka fermento temperatūros optimalumą. Fermento optimali temperatūra atitinka temperatūrą, kurioje fermentinės reakcijos greitis yra didžiausias. Šiltakraujų gyvūnų fermentams paprastai būna 28 o C arba 37 o C.
Toliau didėjant reakcijos mišinio temperatūrai, palaipsniui mažėja fermentinės reakcijos greitis. Šis reiškinys atsiranda dėl baltymų polipeptidinės grandinės terminio denatūravimo proceso. Denatūraciją lydi fermento aktyvaus centro struktūros pasikeitimas, dėl kurio sumažėja fermento afinitetas substratui. Esant aukštesnei nei 55 o C temperatūrai, dauguma fermentų visiškai praranda savo katalizines savybes (inaktyvinami). Šiuo atžvilgiu pasterizavimo procedūrai plačiai taikomas kaitinimas iki 55–56 o C, o tai padidina maisto produktų (pieno ir kt.) galiojimo laiką.
Aplinkos pH turi didelę įtaką fermentinės reakcijos greičiui. Kaip matyti iš parodyto paveikslo. 31 grafike, jis savo forma primena fermentinės reakcijos greičio priklausomybės nuo temperatūros grafiką.
31 pav. Priklausomybė nuo greičio ( V) fermentinė reakcija
dėl aplinkos pH (pH opt – fermento pH optimalus)
Staigus fermentinės reakcijos greičio sumažėjimas esant ekstremalioms pH vertėms yra susijęs su baltymo molekulės polipeptidinės grandinės denatūravimo reiškiniu, veikiant rūgštims ir šarmams. Fermentas turi didžiausią katalizinę galią esant pH vertei, kurią lemia terminas pH optimalus fermentas. Daugumos žinomų fermentų optimalus pH yra nuo 5,0 iki 7,5. Tuo pačiu metu yra daug fermentų pavyzdžių, kuriuose optimali pH vertė perkeliama į rūgštinės arba šarminės pH vertės sritį. Šie fermentai apima:
Fermentinių reakcijų greičio priklausomybės nuo pH priežastis yra ta, kad terpės pH reikšmė turi ryškų poveikį substrato funkcinių grupių jonizacijos laipsniui. Gintaro rūgšties molekulės jonizacijos ypatybės esant skirtingam aplinkos rūgštingumui (pH):
Tuo pačiu metu aplinkos pH taip pat veikia aminorūgščių radikalų, sudarančių aktyvųjį fermento centrą, jonizacijos laipsnį:
Jeigu dėl elektrostatinės sąveikos fermento-substrato komplekso susidarymas stabilizuojamas, tai išryškėja pH vaidmuo, užtikrinant optimalias sąlygas fermentinės reakcijos eigai (24 pav.).
Reakcijų, katalizuojamų fermentų, kurių sąveikoje su substratais elektrostatinė sąveika nėra reikšminga, greitis mažiau priklauso nuo terpės pH. Fig. 32 paveiksle parodyta baltymų hidrolizės greičio priklausomybė nuo papaino. Sąveikaujant šiam fermentui su substratu, hidrofobinė sąveika tampa svarbiausia. Kaip matyti iš pateiktos diagramos, papainas paprastai neturi aiškiai apibrėžto pH optimalaus.
32 pav. pH įtaka baltymų hidrolizės greičiui papainu.
Fermentai turi tam tikrą specifiškumas apie substratus. Specifiškumas reiškia fermentų gebėjimą katalizuoti vieno ar struktūriškai panašių substratų grupės transformaciją. Yra keletas fermentų specifiškumo tipų.
· Absoliutus specifiškumas. Tai reiškia fermento gebėjimą katalizuoti tik vieno substrato transformaciją. Absoliutaus specifiškumo fermentai yra arginazė, urikazės restrikcijos fermentai ir kt.
· Santykinis specifiškumas. Tai reiškia fermento gebėjimą katalizuoti panašios struktūros substratų grupės transformaciją (vadinamieji proteolitiniai fermentai hidrolizuoja įvairius baltymus, glicerolio ir aukštesnių riebalų rūgščių lipazės esterius, heksokinazė fosforilina įvairius monosacharidus). Šiuo atveju specifiškumą lemia tai, kad fermentas veikia tik tam tikro tipo ryšį (proteolitiniai fermentai hidrolizuoja peptidinį ryšį, lipazė hidrolizuoja esterinį ryšį ir kt.).
· Stereospecifiškumas . Šis terminas reiškia fermento gebėjimą katalizuoti vieno substrato stereoizomero konversiją. Taigi fermentai, dalyvaujantys monosacharidų konversijoje, pasižymi specifiškumu jų atžvilgiu D-stereoizomerai, o fermentai, dalyvaujantys aminorūgščių transformacijoje - į jų L-stereoizomerai.
Fermentų aktyvumas
Fermentų, kaip katalizatorių, ypatumas yra tas, kad jie gali pakeisti savo katalizines savybes, veikiami įvairių išorinių veiksnių. Fermentų katalizinio veikimo stiprumo matas yra jų veikla. Fermentų gebėjimas keisti savo veiklą skirtingomis sąlygomis turi didelę biologinę prasmę. Ši savybė leidžia gyvai ląstelei pritaikyti medžiagų apykaitos procesų būseną prie neatidėliotinų ląstelių poreikių, kurie gali labai pasikeisti veikiant įvairiems išoriniams veiksniams.
Fermentų aktyvumo nustatymas vaidina svarbų vaidmenį apibūdinant juos. Yra keletas bendrų fermentų aktyvumo kiekybinio įvertinimo principų. Fermentų aktyvumą galima nustatyti taip:
· arba pagal kaupimosi greitį reakcijos mišinyje, kuriame yra reakcijos produkto fermentas;
· arba pagal fermentinės reakcijos substrato išnykimo iš reakcijos mišinio greitį.
Abu šie metodai yra lygiaverčiai ir gali būti naudojami praktikoje. Tačiau nustatant fermento aktyvumą reikia laikytis šių sąlygų: reakcijos mišinyje, kuriame nustatomas fermento aktyvumas,
· temperatūra turi atitikti fermento temperatūros optimalumą;
· terpės pH turi atitikti šio fermento pH optimalų;
· substrato koncentracija turi būti ne mažesnė kaip prisotinimas;
· turi būti kofaktorių, jei šis fermentas jų turi;
Turi būti fermentų aktyvatorių.
Taigi fermento aktyvumas nustatomas optimaliomis sąlygomis. Esant tokioms sąlygoms, fermento aktyvumas yra proporcingas jo kiekiui tiriamajame mėginyje ir todėl gali būti naudojamas netiesiogiai įvertinti jo koncentraciją.
Fermentų aktyvumas kiekybiškai išreiškiamas veiklos vienetai. Vienas fermento aktyvumo vienetas (U) – tai fermento aktyvumas, kuriam veikiant susidaro 1 µmol reakcijos produkto (arba išnyksta 1 µmol substrato) per minutę.. SI sistemoje fermentinio aktyvumo vienetas yra katal (kat). 1 katalas atitinka fermento aktyvumą, kurio metu susidaro vienas molis reakcijos produkto (išnyksta vienas molis substrato) per sekundę.
Specifinio aktyvumo vertė taip pat naudojama fermentams apibūdinti. Šis vienetas atspindi fermento aktyvumą masės vienete ir išreiškiamas µmol/min mg baltymo. Fermentinių preparatų grynumui įvertinti naudojami specifiniai aktyvumo vienetai. Kuo didesnis specifinis aktyvumas, tuo grynesnis fermentinis preparatas.
Fermentų kinetika tiria įvairių veiksnių (S ir E koncentracijų, pH, temperatūros, slėgio, inhibitorių ir aktyvatorių) įtaką fermentinių reakcijų greičiui. Pagrindinis fermentinių reakcijų kinetikos tyrimo tikslas – gauti informaciją, leidžiančią giliau suprasti fermentų veikimo mechanizmą.
Kinetinė kreivė leidžia nustatyti pradinį reakcijos greitį V 0 .
Substrato prisotinimo kreivė.
Reakcijos greičio priklausomybė nuo fermento koncentracijos.
Reakcijos greičio priklausomybė nuo temperatūros.
Reakcijos greičio priklausomybė nuo pH.
|
|
Daugumos fermentų veikimo optimalus pH yra fiziologiniame diapazone nuo 6,0 iki 8,0. Pepsinas aktyvus esant pH 1,5-2,0, o tai atitinka skrandžio sulčių rūgštingumą. Arginazė, kepenims specifinis fermentas, yra aktyvus 10,0. PH įtaka fermentinės reakcijos greičiui yra susijusi su jonogeninių grupių būkle ir jonizacijos laipsniu fermento ir substrato molekulėse. Šis veiksnys lemia baltymo konformaciją, aktyvaus centro ir substrato būseną, fermento-substrato komplekso susidarymą ir patį katalizės procesą. |
Substrato prisotinimo kreivės matematinis aprašymas, Michaelio konstanta .
|
|
Lygtį, apibūdinančią substrato prisotinimo kreivę, pasiūlė Michaelis ir Menton ir turi jų pavadinimus (Michaelis-Menten lygtis): V = (V MAX *[ S])/(Km+[ S]) , kur Km yra Michaelio konstanta. Nesunku apskaičiuoti, kad esant V = V MAX /2 Km = [S], t.y. Km yra substrato koncentracija, kuriai esant reakcijos greitis yra ½ V MAX. Siekiant supaprastinti V MAX ir Km nustatymą, Michaelis-Menten lygtis gali būti perskaičiuota. 1/V = (Km+[S])/(V MAX *[S]), 1/V = Km/(V MAX *[S]) + 1/V MAX , |
|
|
1/ V = Km/ V MAX *1/[ S] + 1/ V MAX Lineweaver-Burk lygtis. Lygtis, apibūdinanti Lineweaver-Burk diagramą, yra tiesės lygtis (y = mx + c), kur 1/V MAX yra tiesės susikirtimas y ašyje; Km/V MAX - tiesės polinkio kampo liestinė; tiesės susikirtimas su abscisių ašimi suteikia reikšmę 1/Km. Lineweaver-Burk diagrama leidžia nustatyti km iš palyginti nedidelio taškų skaičiaus. Šis grafikas taip pat naudojamas vertinant inhibitorių poveikį, kaip bus aptarta toliau. Km reikšmė labai skiriasi: nuo 10 -6 mol/l labai aktyviems fermentams iki 10 -2 mažo aktyvumo fermentams. |
Km įverčiai turi praktinę vertę. Kai substrato koncentracija yra 100 kartų didesnė už Km, fermentas veiks beveik maksimaliu greičiu, todėl didžiausias greitis V MAX atspindės esamo aktyvaus fermento kiekį. Ši aplinkybė naudojama fermentų kiekiui preparate įvertinti. Be to, Km yra fermento, naudojamo diagnozuojant fermentopatijas, charakteristika.
Fermentų aktyvumo slopinimas.
Ypatingai būdinga ir svarbi fermentų savybė yra jų inaktyvacija veikiant tam tikriems inhibitoriams.
Inhibitoriai - tai medžiagos, sukeliančios dalinį arba visišką fermentų katalizuojamų reakcijų slopinimą.
Fermentinio aktyvumo slopinimas gali būti negrįžtamas arba grįžtamasis, konkurencinis arba nekonkurencinis.
Negrįžtamas slopinimas - tai yra nuolatinis fermento inaktyvavimas, atsirandantis dėl kovalentinio inhibitoriaus molekulės prisijungimo prie aktyviosios vietos arba kitame specialiame centre, kuris keičia fermento konformaciją. Tokių stabilių kompleksų disociacija su laisvo fermento regeneracija praktiškai atmesta. Kad įveiktų tokio slopinimo pasekmes, organizmas turi sintetinti naujas fermentų molekules.
Grįžtamasis slopinimas – pasižymi pusiausvyros inhibitorių kompleksavimu su fermentu dėl nekovalentinių ryšių, dėl kurių tokie kompleksai gali atsiskirti ir atstatyti fermento aktyvumą.
Inhibitoriai skirstomi į konkurencinius ir nekonkurencinius, remiantis tuo, ar jie yra susilpnėję ( konkurencinis slopinimas ) arba nesusilpnėjęs ( nekonkurencinis slopinimas ) jų slopinamasis poveikis padidėjus substrato koncentracijai.
Konkurencingi inhibitoriai - tai, kaip taisyklė, yra junginiai, kurių struktūra yra panaši į substrato struktūrą. Tai leidžia jiems jungtis toje pačioje aktyvioje vietoje kaip ir substratai, neleidžiant fermentui sąveikauti su substratu jau prisijungimo stadijoje. Po prisijungimo inhibitorius gali būti paverstas produktu arba likti aktyvioje vietoje, kol įvyks disociacija.
Grįžtamasis konkurencinis slopinimas gali būti pavaizduotas kaip diagrama:
E↔ E-I → E + P 1
S (neaktyvus)
Fermentų slopinimo laipsnis nustatomas pagal substrato ir fermentų koncentracijų santykį.
Klasikinis šio tipo slopinimo pavyzdys yra sukcinato dehidrogenazės (SDH) aktyvumo slopinimas malatu, kuris išstumia sukcinatą iš substrato vietos ir neleidžia jam virsti fumaratu:
Kovalentinis inhibitoriaus prisijungimas prie aktyvios vietos sukelia fermento inaktyvavimą (negrįžtamas slopinimas). Pavyzdys negrįžtamas konkurencinis slopinimas gali būti naudojamas kaip triosefosfato izomerazės inaktyvavimas 3-chloracetolio fosfatu. Šis inhibitorius yra struktūrinis substrato, dihidroksiacetono fosfato, analogas ir negrįžtamai jungiasi su glutamo rūgšties likučiais aktyvioje vietoje:
Kai kurie inhibitoriai veikia mažiau selektyviai, sąveikaudami su specifine funkcine grupe skirtingų fermentų aktyvioje vietoje. Taigi, jodoacetato ar jo amido prisijungimas prie aminorūgšties cisteino SH grupės, esančios aktyviajame fermento centre ir dalyvaujančios katalizėje, visiškai praranda fermento aktyvumą:
R-SH + JCH 2 COOH → HJ + R-S-CH 2 COOH
Todėl šie inhibitoriai inaktyvuoja visus fermentus, kurių katalizėje dalyvauja SH grupės.
Negrįžtamas hidrolazių slopinimas veikiant nervinėms dujoms (sarinas, somanas) atsiranda dėl jų kovalentinio prisijungimo prie serino liekanos aktyviajame centre.
Konkurencinio slopinimo metodas buvo plačiai pritaikytas medicinos praktikoje. Sulfonamidiniai vaistai, p-aminobenzenkarboksirūgšties antagonistai, gali būti metabolizuojamų konkurencinių inhibitorių pavyzdys. Jie jungiasi su dihidropterato sintetaze – bakterijų fermentu, paverčiančiu p-aminobenzoatą į folio rūgštį, būtiną bakterijų augimui. Bakterija žūva dėl to, kad surištas sulfanilamidas virsta kitu junginiu ir nesusidaro folio rūgštis.
Nekonkurencingi inhibitoriai paprastai prisijungia prie fermento molekulės kitoje nei substrato surišimo vieta, o substratas tiesiogiai nekonkuruoja su inhibitoriumi. Kadangi inhibitorius ir substratas jungiasi prie skirtingų centrų, galimas ir E-I komplekso, ir S-E-I komplekso susidarymas. S-E-I kompleksas taip pat suyra, kad susidarytų produktas, tačiau lėčiau nei E-S, todėl reakcija sulėtės, bet nesustos. Taigi, gali vykti šios lygiagrečios reakcijos:
E↔ E-I ↔ S-E-I → E-I + P
Grįžtamasis nekonkurencinis slopinimas yra gana retas.
Nekonkurenciniai inhibitoriai vadinami alosterinis skirtingai nuo konkurencinių ( izosterinis ).
Grįžtamąjį slopinimą galima kiekybiškai ištirti naudojant Michaelis-Menten lygtį.
Esant konkurenciniam slopinimui, V MAX išlieka pastovus, o Km didėja.
|
|
|
Esant nekonkurenciniam slopinimui, V MAX sumažėja, o Km nesikeičia.
|
|
|
Jei reakcijos produktas slopina fermentą, kuris katalizuoja jo susidarymą, toks slopinimo būdas vadinamas retroinhibicija arba grįžtamojo ryšio slopinimas . Pavyzdžiui, gliukozė slopina gliukozės-6-fosfatazę, kuri katalizuoja gliukozės-6-fosfato hidrolizę.
Biologinė šio slopinimo reikšmė yra tam tikrų medžiagų apykaitos takų reguliavimas (žr. kitą pamoką).
PRAKTINĖ DALIS
Užduotis studentams
1. Ištirti baltymų denatūraciją veikiant mineralinių ir organinių rūgščių tirpalams bei kaitinant.
2. Aptikti kofermentą NAD mielėse.
3. Nustatykite amilazės aktyvumą šlapime (kraujo serume).
9. ATSAKYMŲ Į PROBLEMUS STANDARTAI, testo klausimai, naudojami žinioms kontroliuoti klasėje (gali būti naudojamas kaip priedas)
10. GALIMI UGDYMO IR TYRIMŲ DARBŲ TEMA POBŪDIS IR APIMTIS
(Nurodykite konkrečiai UIRS pobūdį ir formą: abstrakčių prezentacijų rengimas, savarankiškų tyrimų vykdymas, simuliaciniai žaidimai, ligos istorijos rengimas naudojant monografinę literatūrą ir kitas formas)
Fermentų kinetika tiria fermentų katalizuojamų reakcijų greitį priklausomai nuo įvairių jų sąveikos su substratu sąlygų (koncentracijos, temperatūros, pH ir kt.).
Tačiau fermentai yra baltymai, jautrūs įvairių išorinių poveikių įtakai. Todėl tiriant fermentinių reakcijų greitį daugiausiai atsižvelgiama į reaguojančių medžiagų koncentracijas, o stengiamasi iki minimumo sumažinti temperatūros, aplinkos pH, aktyvatorių, inhibitorių ir kitų faktorių įtaką bei sukurti standartines sąlygas. Pirma, tai yra aplinkos pH vertė, kuri yra optimali tam tikram fermentui. Antra, jei įmanoma, rekomenduojama palaikyti 25°C temperatūrą. Trečia, pasiekiamas visiškas fermento prisotinimas substratu. Šis punktas ypač svarbus, nes esant žemai substrato koncentracijai, reakcijoje dalyvauja ne visos fermentų molekulės (6.5 pav. A), o tai reiškia, kad rezultatas bus toli gražu ne maksimalus. Didžiausia katalizuojamos reakcijos galia, kitiems dalykams esant vienodai, pasiekiama, jei transformacijoje dalyvauja kiekviena fermento molekulė, t.y. esant didelei fermento-substrato komplekso koncentracijai (6.5 pav., V). Jei substrato koncentracija neužtikrina visiško fermento prisotinimo (6.5 pav., b), tada reakcijos greitis nepasiekia didžiausios vertės.
Ryžiai. 65.
A - esant žemai substrato koncentracijai; 6 - esant nepakankamai substrato koncentracijai; V - kai fermentas yra visiškai prisotintas substrato
Fermentinės reakcijos greitis, išmatuotas esant aukščiau nurodytoms sąlygoms ir visiškam fermento prisotinimui substratu, vadinamas didžiausias fermentinės reakcijos greitis (V).
Fermentinės reakcijos greitis, nustatomas, kai fermentas nėra visiškai prisotintas substrato, žymimas v.
Fermentų katalizę galima supaprastinti pagal šią diagramą:
kur F yra fermentas; S - substratas; FS – fermento-substrato kompleksas.
Kiekvienam šio proceso etapui būdingas tam tikras greitis. Fermentinės reakcijos greičio matavimo vienetas yra substrato molių skaičius, paverstas per laiko vienetą(toks pat kaip ir įprastos reakcijos greitis).
Fermento sąveika su substratu lemia fermento-substrato komplekso susidarymą, tačiau šis procesas yra grįžtamas. Tiesioginių ir atvirkštinių reakcijų greičiai priklauso nuo reagentų koncentracijos ir yra apibūdinami atitinkamomis lygtimis:
Pusiausvyros būsenoje galioja (6.3) lygtis, nes tiesioginių ir atvirkštinių reakcijų greičiai yra vienodi.
Pakeitę pirmyn (6.1) ir atgal (6.2) reakcijų greičio reikšmes į (6.3) lygtį, gauname lygybę:
Pusiausvyros būsenai būdinga tinkama pusiausvyros konstanta K p, lygus tiesioginės ir atvirkštinės reakcijos konstantų santykiui (6.5). Pusiausvyros konstantos atvirkštinė vertė vadinama substrato konstanta Ks, arba fermento ir substrato komplekso disociacijos konstanta:
Iš (6.6) lygties aišku, kad esant didelėms fermento-substrato komplekso koncentracijoms, substrato konstanta mažėja, t.y. su dideliu stabilumu. Todėl substrato konstanta apibūdina fermento ir substrato afinitetą bei fermento ir substrato komplekso susidarymo ir disociacijos greičio konstantų santykį.
Fermentų prisotinimo substratu fenomeną tyrė Leonor Michaelis ir Maud Mepten. Remdamiesi matematiniu rezultatų apdorojimu, jie išvedė (6.7) lygtį, kuri gavo savo pavadinimus, iš kurių aišku, kad esant didelei substrato koncentracijai ir mažai substrato konstantos vertei, fermentinės reakcijos greitis yra didžiausias. . Tačiau ši lygtis yra ribota, nes joje neatsižvelgiama į visus parametrus:
Reakcijos metu fermento-substrato kompleksas gali keistis įvairiomis kryptimis:
- disocijuoti į pirmines medžiagas;
- virsta produktu, nuo kurio fermentas atskiriamas nepakitęs.
Todėl norint apibūdinti bendrą fermentinio proceso veiksmą, sąvoką Michaelio konstantos Kt, kuri išreiškia ryšį tarp visų trijų fermentinės katalizės reakcijų greičio konstantų (6.8). Jei abu terminai yra padalinti iš fermento ir substrato komplekso susidarymo reakcijos greičio konstantos, gauname išraišką (6.9):
Iš (6.9) lygties išplaukia svarbus rezultatas: Michaelio konstanta visada yra didesnė už substrato konstantą k 2 /k v
Skaitmeniškai K t lygi substrato koncentracijai, kuriai esant reakcijos greitis yra pusė didžiausio galimo greičio ir atitinka fermento prisotinimą substratu, kaip parodyta Fig. 6,5, b. Kadangi praktiškai ne visada įmanoma pasiekti visišką fermento prisotinimą substratu, tai būtent K t naudojamas lyginamajam fermentų kinetinių charakteristikų apibūdinimui.
Fermentinės reakcijos greitis, kai fermentas nėra visiškai prisotintas substrato (6.10), priklauso nuo fermento-substrato komplekso koncentracijos. Proporcingumo koeficientas yra fermento ir produkto išsiskyrimo reakcijos konstanta, nes tai keičia fermento ir substrato komplekso koncentraciją:
Po transformacijų, atsižvelgiant į minėtas priklausomybes, fermentinės reakcijos greitis, kai fermentas nevisiškai prisotinamas substratu, aprašomas (6.11) lygtimi, t.y. priklauso nuo fermento, substrato koncentracijų ir jų giminingumo K s:
Grafinė fermentinės reakcijos greičio priklausomybė nuo substrato koncentracijos nėra tiesinė. Kaip matyti iš fig. 6.6, didėjant substrato koncentracijai, stebimas fermentų aktyvumo padidėjimas. Tačiau kai pasiekiamas maksimalus fermento prisotinimas substratu, fermentinės reakcijos greitis tampa didžiausias. Todėl reakcijos greitį ribojantis veiksnys yra fermento ir substrato komplekso susidarymas.
Praktika parodė, kad substrato koncentracijos, kaip taisyklė, išreiškiamos vertėmis, daug mažesnėmis už vienetą (10 6 -10 3 mol). Skaičiuojant tokiais kiekiais operuoti gana sunku. Todėl G. Lineweaveris ir D. Burke'as pasiūlė grafinę fermentinės reakcijos greičio priklausomybę išreikšti ne tiesioginėmis, o atvirkštinėmis koordinatėmis. Jie rėmėsi prielaida, kad vienodiems kiekiams jų atvirkštinės vertės taip pat yra lygios:
Ryžiai. 6.6.
Pakeitę išraišką (6.13), gauname išraišką, vadinamą Lineweaver-Burk lygtis (6.14):
Lineweaver-Burk lygties grafinė priklausomybė yra tiesinė (6.7 pav.). Fermento kinetinės charakteristikos nustatomos taip:
- ordinačių ašyje nupjauta atkarpa lygi 1/V;
- abscisių ašyje nupjauta atkarpa lygi -1 /Į t.
Ryžiai. 6.7.
Manoma, kad Lineweaver-Burk metodas leidžia tiksliau nustatyti maksimalų reakcijos greitį nei tiesioginėmis koordinatėmis. Iš šios diagramos taip pat galima gauti vertingos informacijos apie fermentų slopinimą.
Yra ir kitų būdų transformuoti Michaelis-Menten lygtį. Įvairių išorinių poveikių įtakai fermentiniam procesui tirti naudojamos grafinės priklausomybės.
Ši enzimologijos šaka tiria įvairių veiksnių įtaką fermentinės reakcijos greičiui. Atsižvelgiant į bendrąją vieno substrato pavertimo vienu produktu grįžtamosios reakcijos fermentinės katalizės lygtį (1),
Reikėtų įvardyti pagrindinius veiksnius, turinčius įtakos fermentinės reakcijos greičiui: substrato koncentracija [S], fermento koncentracija [E] ir reakcijos produkto koncentracija [P].
Kai kurių fermentų sąveiką su jų substratu galima apibūdinti fermentinės reakcijos greičio V priklausomybės nuo substrato koncentracijos [S] hiperboline kreive (19 pav.):
19 pav. Fermentinės reakcijos greičio priklausomybė nuo substrato koncentracijos.
Šioje kreivėje galima išskirti tris pjūvius, kuriuos galima paaiškinti fermento sąveikos su substratu mechanizmo nuostatomis: OA - tiesiogiai proporcingos V priklausomybės nuo [S], fermento aktyvių centrų, atkarpa. palaipsniui užpildomi substrato molekulėmis, susidarant nestabiliam kompleksui ES; AB skyrius – kreivinė V priklausomybė nuo [S], dar nepasiektas visiškas fermento aktyviųjų centrų prisotinimas substrato molekulėmis. ES kompleksas yra nestabilus prieš pasiekdamas pereinamąją būseną, atvirkštinės disociacijos į E ir S tikimybė vis dar yra didelė; atkarpa BC - priklausomybė apibūdinama nulinės eilės lygtimi, atkarpa lygiagreti [S] ašiai, pasiektas pilnas aktyvių fermentų prisotinimas substrato molekulėmis, V=V max.
Būdinga kreivės forma matematiškai apibūdinama Briggs-Haldane lygtimi:
V=V maks. ● [S]/ Km + [S] (2),
kur Km yra Michaelis-Menten konstanta, skaitinė lygi substrato koncentracijai, kuriai esant fermentinės reakcijos greitis yra lygus pusei V max.
Kuo mažesnis fermento K m, tuo didesnis fermento afinitetas substratui, tuo greičiau pasiekiama pereinamoji būsena substratui ir jis virsta reakcijos produktu. Norint nustatyti šio fermento biologinį vaidmenį ląstelėje, svarbu rasti kiekvienos grupės specifinio fermento substrato Km vertes.
Daugumai fermentų neįmanoma sudaryti hiperbolinės kreivės (19 pav.) Šiuo atveju naudojamas dvigubų reciprokų metodas (Lineweaver-Burk), t.y. nubraižyta grafinė 1/[V] priklausomybė nuo 1/[S] (20 pav.). Tokių kreivių sudarymo metodas eksperimente yra labai patogus tiriant įvairių tipų inhibitorių poveikį fermentų aktyvumui (žr. toliau tekste).
20 pav. 1/[V] ir 1/[S] grafikas (Lineweaver-Burk metodas),
kur y yra ribinė atkarpa - , o x yra ribinė atkarpa - 
, kampo liestinė α - .
Fermentinės reakcijos greičio V priklausomybė nuo fermento koncentracijos [E].
Ši grafinė priklausomybė (21 pav.) nagrinėjama esant optimaliai aplinkos temperatūrai ir pH, kai substrato koncentracija yra žymiai didesnė už fermento aktyviųjų centrų soties koncentraciją.
Ryžiai. 21. Fermentų koncentracijos įtaka fermentinės reakcijos greičiui.
Fermentinės reakcijos greičio priklausomybė nuo kofaktoriaus arba kofermento koncentracijos. Kalbant apie sudėtingus fermentus, reikia atsižvelgti į tai, kad vitaminų kofermentinių formų trūkumas hipovitaminozės atveju ir metalų jonų patekimo į organizmą pažeidimas būtinai sumažina atitinkamų fermentų, reikalingų kursui, koncentraciją. medžiagų apykaitos procesai. Todėl darytina išvada, kad fermento aktyvumas tiesiogiai priklauso nuo kofaktoriaus arba kofermento koncentracijos.
Produkto koncentracijos įtaka fermentinės reakcijos greičiui.Žmogaus organizme vykstančių grįžtamųjų reakcijų atveju reikia atsižvelgti į tai, kad tiesioginės reakcijos produktus fermentas gali panaudoti kaip atvirkštinės reakcijos substratus. Todėl srauto kryptis ir Vmax pasiekimo momentas priklauso nuo pradinių substratų ir reakcijos produktų koncentracijų santykio. Pavyzdžiui, alanino aminotransferazės, kuri katalizuoja transformaciją, aktyvumas:
Alaninas + Alfa-ketoglutaratas ↔ Piruvatas + Glutamatas
priklauso nuo koncentracijos santykio ląstelėje:
[alaninas + alfa-ketoglutaratas] / [piruvatas + glutamatas].
FERMENTO VEIKIMO MECHANIZMAS. FERMENTŲ KATALIZĖS TEORIJOS
Fermentai, kaip ir nebaltyminiai katalizatoriai, padidina cheminės reakcijos greitį dėl savo gebėjimo sumažinti šios reakcijos aktyvacijos energiją. Fermentinės reakcijos aktyvavimo energija apskaičiuojama kaip skirtumas tarp energijos vertės vykstančios reakcijos sistemoje, pasiekusios pereinamąją būseną, ir energijos, nustatytos reakcijos pradžioje (žr. grafinę priklausomybę 22 pav.).
Ryžiai. 22. Cheminės reakcijos be fermento (1) ir esant fermentui (2) energetinės būsenos grafinė priklausomybė nuo reakcijos laiko.
V. Henry ir ypač L. Michaelis, M. Menten darbas tiriant monosubstrato grįžtamųjų fermentinių reakcijų mechanizmą leido teigti, kad fermentas E pirmiausia grįžtamai ir gana greitai susijungia su jo substratu S, sudarydamas fermentą. substrato kompleksas (ES):
E+S<=>ES (1)
ES susidaro dėl vandenilinių ryšių, elektrostatinės, hidrofobinės sąveikos, kai kuriais atvejais kovalentinių, koordinacinių ryšių tarp aktyvaus centro aminorūgščių liekanų šoninių radikalų ir substrato funkcinių grupių. Sudėtinguose fermentuose kontakto su substratu funkciją gali atlikti ir nebaltyminė struktūros dalis.
Tada fermento-substrato kompleksas suyra per antrą, lėtesnę, grįžtamąją reakciją, kad susidarytų reakcijos produktas P ir laisvasis fermentas E:
ES<=>EP<=>E + P (2)
Šiuo metu dėl minėtų mokslininkų, taip pat Keilin D., Chance B., Koshland D. darbų ("indukuotos korespondencijos" teorija) yra teorinių nuostatų apie keturis pagrindinius veikimo mechanizmo taškus. fermento ant substrato, kurie lemia fermentų gebėjimą pagreitinti chemines reakcijas:
1. Orientacija ir požiūris . Fermentas gali surišti substrato molekulę taip, kad fermento atakuojamas ryšys būtų ne tik arti katalizinės grupės, bet ir tinkamai orientuotas jos atžvilgiu. Tikimybė, kad ES kompleksas pasieks pereinamąją būseną dėl orientacijos ir artumo, labai padidėja.
2. Stresas ir įtampa : paskatintas susirašinėjimas. Substrato prijungimas gali sukelti konformacinius fermento molekulės pokyčius, dėl kurių atsiranda įtampa aktyvaus centro struktūroje, taip pat šiek tiek deformuojamas surištas substratas, taip palengvinant ES komplekso pereinamąją būseną. Tarp molekulių E ir S atsiranda vadinamasis indukuotas atitikimas.
Fermentinių reakcijų greitis priklauso nuo fermento koncentracijos, substrato, temperatūros, pH, aktyvatorių ir inhibitorių buvimo.
Esant substrato pertekliui, reakcijos greitis tiesiogiai proporcingas fermentų koncentracija (3.2 pav.).
Ryžiai. 3.2. Reakcijos greičio priklausomybė nuo fermento koncentracijos.
Reakcijos greičio priklausomybė nuo substrato koncentracija pateikta 3.3 pav.
Ryžiai. 3.3. Reakcijos greičio priklausomybė nuo substrato koncentracijos.
Grafike yra 3 skyriai. Esant mažai substrato koncentracijai (skyrius A) reakcijos greitis yra tiesiogiai proporcingas substrato koncentracijai ir paklūsta pirmos eilės kinetikai. Vieta įjungta b(mišrios eilės reakcija) ši priklausomybė pažeidžiama. Vieta įjungta c reakcijos greitis yra didžiausias ir nepriklauso nuo substrato koncentracijos.
Fermentinei reakcijai būdingas fermento-substrato komplekso susidarymas, kuris suyra ir susidaro laisvas fermentas ir reakcijos produktas.
Šioje lygtyje k 1 yra fermento ir substrato komplekso susidarymo greičio konstanta, k 2 yra fermento ir substrato komplekso disociacijos konstanta, kad susidarytų laisvas fermentas ir substratas, o k 3 yra disociacijos greičio konstanta. fermento-substrato kompleksas virsta laisvu fermentu ir reakcijos produktu.
Michaelis ir Mentenas pasiūlė lygtį, kuri apibūdina reakcijos greičio priklausomybę nuo substrato koncentracijos.
v yra reakcijos greitis esant tam tikrai substrato koncentracijai; Ks – fermento-substrato komplekso disociacijos konstanta; Vmax – maksimalus reakcijos greitis.
Ks=k -2 /k 1 t.y. atvirkštinės reakcijos konstantos ir tiesioginės reakcijos konstantos santykis.
Tačiau ši lygtis apibūdina tik skyrių A grafike ir neatsižvelgiama į reakcijos produktų įtaką fermentinio proceso greičiui.
Haldane'as ir Briggsas disociacijos konstantą lygtyje pakeitė Michaelio konstanta (Km).
Michaelis pastovus skaičiais lygi substrato koncentracijai, kai reakcijos greitis yra pusė didžiausio. Michaelio konstanta apibūdina fermento ir substrato afinitetą. Didelis fermento afinitetas substratui pasižymi maža Km reikšme ir atvirkščiai.
Naudoti Michaelis ir Menten pasiūlytą grafiką yra nepatogu. Patogesniam grafiniam vaizdavimui G. Lineweaveris ir D. Burke'as Haldane'o ir Briggso lygtį transformavo dvigubų atvirkštinių dydžių metodu, remdamiesi principu, kad jei tarp dviejų dydžių yra lygybė, tai ir atvirkštiniai dydžiai bus lygūs.
Grafinis reakcijos greičio priklausomybės vaizdas nuo pH turi varpelio formą. PH vertė, kuriai esant fermentas pasižymi didžiausiu aktyvumu, vadinama optimalus pH(5.4 pav. A) . Daugumos fermentų optimalus pH yra 6-8. Išimtis yra pepsinas, kurio optimalus yra 2,0. Kai pH kinta viena ar kita kryptimi nuo optimalaus, reakcijos greitis mažėja dėl fermento ir substrato funkcinių grupių jonizacijos, dėl ko sutrinka fermento-substrato komplekso susidarymas.
Ryžiai. 3.4. Reakcijos greičio priklausomybė nuo pH (A) ir temperatūros (B).
Cheminės reakcijos greitis didėja 2 kartus temperatūros iki 10°C. Tačiau dėl fermento baltyminio pobūdžio, toliau kylant temperatūrai, vyksta fermento denatūracija. Temperatūra, kurioje reakcijos greitis yra didžiausias, vadinama optimali temperatūra(3.4 pav. B) . Daugumai fermentų optimali temperatūra yra 37-40°C. Išimtis yra raumenų miokinazė, kuri gali atlaikyti kaitinimą iki 100°C.
Fermentų aktyvatoriai– tai medžiagos 1), sudarančios aktyvųjį fermento centrą (Co 2+, Mg 2+, Zn 2+, Fe 2+, Ca 2+); 2) palengvinti fermento-substrato komplekso (Mg 2+) susidarymą; 3) redukuojančias SH grupes (glutationą, cisteiną, merkaptoetanolį); 4) stabilizuojant natūralią baltymo fermento struktūrą. Fermentines reakcijas dažniausiai suaktyvina katijonai (periodinėje lentelėje nuo 19 iki 30). Anijonai yra mažiau aktyvūs, nors chloro jonai ir kai kurių kitų halogenų anijonai gali aktyvuoti pepsiną, amilazę ir adenilato ciklazę. Baltymai gali būti aktyvatoriai: apoproteinas A-I (LCAT), apoproteinas C-II (LPL).
Aktyvatorių veikimo mechanizmas:
1) dalyvauti formuojant aktyvųjį fermentų centrą;
2) palengvinti substrato ir fermento surišimą;
3) dalyvauti formuojant natūralią fermento struktūrą.
Inhibitoriai– medžiagos, kurios iš dalies arba visiškai slopina fermentų katalizuojamas reakcijas.
Inhibitoriai skirstomi į nespecifinis Ir specifinis. Nespecifinių inhibitorių veikimas nesusijęs su fermentų veikimo mechanizmu. Šie inhibitoriai sukelia fermento baltymo denatūravimą (šiluma, rūgštys, šarmai, sunkiųjų metalų druskos ir kt.).
Specifiniai inhibitoriai veikia fermentų veikimo mechanizmą. Specifiniai inhibitoriai skirstomi į 2 grupes: grįžtamasis ir negrįžtamas. Negrįžtami inhibitoriai sukelia nuolatinį, negrįžtamą fermento funkcinių grupių pasikeitimą arba modifikaciją dėl glaudaus arba kovalentinio prisijungimo. Į šią grupę įeina: 1) metalo inhibitoriai fermentai (HCN, RCN, HF, CO ir kt.). Šie junginiai jungiasi su kintamo valentingumo metalais (Cu arba Fe), dėl to sutrinka elektronų pernešimo išilgai fermentų kvėpavimo grandinės procesas. Todėl šie inhibitoriai vadinami kvėpavimo takų nuodais. 2) SH grupių turinčių fermentų inhibitoriai(monoidoacetatas, dijodoacetatas, jodoacetamidas, arseno ir gyvsidabrio junginiai). 3) fermentų, kurių aktyviajame centre yra OH grupė, inhibitoriai (organiniai fosforo junginiai, insekticidai). Šie inhibitoriai pirmiausia slopina cholinesterazės – fermento, kuris vaidina pagrindinį vaidmenį nervų sistemos veikloje – aktyvumą.
Grįžtamasis slopinimą galima kiekybiškai įvertinti naudojant Michaelis-Menten lygtį. Grįžtamieji inhibitoriai skirstomi į konkurencingas ir nekonkurencingas.
Konkurencingi inhibitoriai- Tai medžiagos, panašios į substratą. Inhibitorius jungiasi prie aktyvios fermento vietos ir neleidžia susidaryti fermento ir substrato kompleksui.
Klasikinis konkurencinio slopinimo pavyzdys yra sukcinato dehidrogenazės slopinimas malono rūgštimi. Sukcinato dehidrogenazė katalizuoja gintaro rūgšties (sukcinato) oksidaciją dehidrogenuojant į fumaro rūgštį.
Jei į terpę pridedama malono rūgšties (inhibitoriaus), dėl savo struktūrinio panašumo į tikrąjį substrato sukcinatą ji reaguos su aktyvia vieta ir sudarys fermento inhibitorių kompleksą, tačiau reakcija neįvyks.
Inhibitoriaus poveikis pašalinamas didėja substrato koncentracija. Esant konkurenciniam slopinimui, pasikeičia fermentinių reakcijų kinetika: Km didėja, V max išlieka pastovus(3.5 pav.).
Ryžiai. 3.5. Konkurencinių inhibitorių poveikis fermentinės reakcijos greičiui
Konkurencinio slopinimo metodas buvo pritaikytas medicinos praktikoje kaip antimetabolitai.
Pavyzdžiui, sulfonamidų vaistais gydomos kai kurios bakterijų sukeltos infekcinės ligos. Šie vaistai savo struktūra yra panašūs į para-aminobenzenkarboksirūgštį, kurią bakterijų ląstelė naudoja folio rūgšties, reikalingos bakterijų gyvenimui, sintezei. Dėl šio struktūrinio panašumo sulfonamidas blokuoja fermento veikimą, iš komplekso išstumdamas para-aminobenzenkarboksirūgštį su fermentu, kuris sintetina folio rūgštį.
Nekonkurencingi inhibitoriai - medžiagos, kurios struktūriškai nėra panašios į substratus. Nekonkurencingi inhibitoriai jungiasi ne prie aktyvios vietos, o su kita fermento molekulės vieta, pavyzdžiui, alosteriniame centre. Taip pakeičiama aktyvaus centro konformacija, kad sutrinka substrato sąveika su juo.
Dėl nekonkurencinio slopinimo: V max mažėja, bet K m nesikeičia(3.6 pav.).
