Små RNA och cancer. Genuttryck och små RNA i onkologi Små RNA
SiRNA är 21-25 bp i längd och härrör från dsRNA. Källan till sådana RNA kan vara virusinfektioner, genetiska konstruktioner som introduceras i genomet, långa hårnålar i transkript och dubbelriktad transkription av mobila element.
dsRNA skärs av Dicer RNase i 21-25 bp fragment. med 3 "ändar som sticker ut med 2 nukleotider, varefter en av strängarna är en del av RISC och styr klyvningen av homologa RNA. RISC innehåller siRNA motsvarande både plus och minus strängar av dsRNA. siRNA har inte sina egna gener och representerar är fragment av längre RNA. siRNA styr klyvningen av mål-RNA, eftersom de är helt komplementära till det. I växter, svampar och nematoder är RNA-beroende RNA-polymeraser inblandade i processen att undertrycka genuttryck, för vilket siRNA också tjänar som primers (frön för syntes av nytt RNA Det resulterande dsRNA skärs av Dicer, nya siRNA bildas, vilka är sekundära, vilket förstärker signalen. 
RNA -störning
1998 publicerade Craig C. Mello och Andrew Fire i Nature, där det stod att dubbelsträngat RNA (dsRNA) kan undertrycka genuttryck. Senare visade det sig att den aktiva principen i denna process är korta enkelsträngade RNA. Mekanismen för att undertrycka genuttryck med användning av dessa RNA heter
RNA -störningar samt RNA -tystnad. Denna mekanism finns i alla stora taxa av eukaryoter: ryggradsdjur och ryggradslösa djur, växter och svampar. 2006 fick Nobelpriset för denna upptäckt.
Undertryckande av uttryck kan ske på transkriptionell nivå eller efter transkriptionellt. Det visade sig att i alla fall krävs en liknande uppsättning proteiner och korta (21-32 bp) RNA.
siRNA reglerar genaktivitet på två sätt. Som diskuterats ovan styr de klyvningen av mål -RNA. Detta fenomen kallas "undertryckande" ( kvälning) i svamp, " post-translationell genavstängning"i växter och" RNA -störning
"hos djur. siRNA 21-23 bp i längd är involverade i dessa processer. En annan typ av handling är siRNA som kan undertrycka transkription av gener som innehåller homologa siRNA-sekvenser. Detta fenomen fick namnet transkriptionell genavstängning
(TGS) och finns i jäst, växter och djur. siRNA styr också DNA -metylering, vilket resulterar i heterokromatinbildning och transkriptionell repression. TGS studeras bäst i jäst S. pombe, där det konstateras att siRNA sätts in i ett RISC-liknande proteinkomplex som kallas RITS. I hans fall, liksom i fallet med RISC, interagerar siRNA med ett protein från AGO -familjen. Det är troligt att siRNA kan rikta detta komplex till en gen som innehåller ett homologt siRNA -fragment. Därefter rekryterar RITS -proteiner metyltransferaser, vilket resulterar i att heterokromatin bildas i lokuset som kodar för siRNA -målgenen och aktivt uttryck av genen avslutas. 
Roll i cellulära processer
Vilken betydelse har siRNA i cellen?
siRNA är inblandade i cellförsvar mot virus, transgent förtryck, reglering av vissa gener och bildandet av centromert heterokromatin. En viktig funktion av siRNA är att undertrycka uttrycket av mobila genetiska element. Sådan undertryckning kan ske både på transkriptionell nivå och efter transkriptionellt.
Genom för vissa av virusen består av DNA, medan andra består av RNA, och RNA för virus kan vara antingen enkel- eller dubbelsträngad. Processen att skära främmande (viralt) mRNA själv sker i detta fall på samma sätt som beskrivits ovan, det vill säga genom att aktivera RISC -enzymkomplexet. För ökad effektivitet har dock växter och insekter uppfunnit ett unikt sätt att förbättra den skyddande effekten av siRNA. Genom att fästa till mRNA -strängen kan siRNA -stället, med hjälp av DICER -enzymkomplexet, först slutföra den andra mRNA -strängen och sedan klippa den på olika ställen och på så sätt skapa en mängd "sekundära" siRNA. De bildar i sin tur RISC och bär mRNA genom alla de steg som diskuterats ovan, fram till dess fullständiga förstörelse. Sådana "sekundära" molekyler kommer att kunna binda specifikt inte bara till regionen av det virala mRNA som den "primära" molekylen var riktad till, utan också till andra regioner, vilket kraftigt förbättrar effektiviteten av cellulärt försvar.
Således är siRNA i växter och lägre djurorganismer en viktig länk i ett slags "intracellulär immunitet", vilket gör det möjligt att känna igen och förstöra främmande RNA. Om ett RNA-innehållande virus tränger in i cellen kommer ett sådant försvarssystem att hindra det från att föröka sig. Om viruset innehåller DNA kommer siRNA -systemet att hindra det från att producera virala proteiner (eftersom mRNA som krävs för detta kommer att identifieras och skäras), och att använda denna strategi kommer att bromsa spridningen i kroppen.
Hos däggdjur, till skillnad från insekter och växter, fungerar ett annat försvarssystem. När ett främmande RNA kommer in i en "mogen" (differentierad) däggdjurscell, vars längd är mer än 30 bp, börjar cellen att syntetisera interferon. Interferon, genom att binda till specifika receptorer på cellytan, kan stimulera en hel grupp gener i cellen. Som ett resultat syntetiseras flera typer av enzymer i cellen som hämmar proteinsyntesen och bryter ner virala RNA. Dessutom kan interferon verka på närliggande, ännu inte infekterade celler, och därigenom blockera eventuell spridning av viruset.
Som du kan se är båda systemen lika på många sätt: de har ett gemensamt mål och "arbetsmetoder". Även namnen "interferon" och "(RNA) interferens" kommer från en gemensam rot. Men de har också en mycket signifikant skillnad: om interferon vid de första tecknen på invasion helt enkelt "fryser" cellens arbete och förhindrar (för säkerhets skull) produktionen av många, inklusive "oskyldiga" proteiner i cellen, då siRNA -systemet är extremt läsbart: varje siRNA känner bara igen och förstör sitt eget specifika mRNA. Substitution av bara en nukleotid i siRNA leder till en kraftig minskning av effekten av interferens ... Ingen hittills känd genblockerare har denna exceptionella specificitet för dess målgen.
Upptäckten av RNA -störningar har gett nytt hopp i kampen mot aids och cancer. Kanske, genom att använda siRNA -terapi i kombination med traditionell antiviral terapi, är det möjligt att uppnå en potentieringseffekt när de två effekterna leder till en mer uttalad terapeutisk effekt än den enkla summan av varje applicerad separat.
För att använda siRNA-störningsmekanismen i däggdjursceller måste färdiga dubbelsträngade siRNA-molekyler införas i cellerna. Den optimala storleken på sådana syntetiska siRNA är samma 21-28 nukleotider. Om du ökar dess längd kommer cellerna att svara med produktion av interferon och en minskning av proteinsyntes. Syntetiska siRNA kan komma in i både infekterade och friska celler, och en minskning av proteinproduktionen i oinfekterade celler kommer att vara mycket oönskad. Å andra sidan, om man försöker använda siRNA mindre än 21 nukleotider, reduceras specificiteten för dess bindning till det önskade mRNA och förmågan att bilda ett RISC -komplex kraftigt.
Om siRNA kan levereras på ett eller annat sätt som har förmågan att binda till någon del av HIV -genomet (som som bekant består av RNA) kan man försöka förhindra dess insättning i värdcellens DNA. Dessutom utvecklar forskare sätt att påverka de olika stadierna av HIV -reproduktion i en redan infekterad cell. Det senare tillvägagångssättet kommer inte att ge botemedel, men det kan avsevärt minska reproduktionstakten av viruset och ge det hörnade immunsystemet en chans att "vila" från virusattacken och försöka hantera resterna av själva sjukdomen . I figuren är de två stadierna av HIV -reproduktion i en cell som forskare hoppas kan blockeras med siRNA markerade med röda kors (steg 4-5 - införandet av viruset i kromosomen och steg 5-6 - sammansättningen av viruset och lämna cellen). 
Hittills gäller dock allt ovanstående endast för teoriområdet. I praktiken stöter siRNA -terapi på svårigheter som forskare ännu inte har kunnat undvika. Till exempel, när det gäller antiviral terapi, är det den höga specificiteten hos siRNA som kan spela ett grymt skämt: som du vet har virus förmågan att snabbt mutera, d.v.s. ändra sammansättningen av sina nukleotider. HIV har särskilt lyckats med detta, frekvensen av förändringar som är sådan att hos en person som har smittats med en subtyp av viruset kan en helt annan subtyp isoleras på några år. I detta fall blir den modifierade HIV -stammen automatiskt okänslig för siRNA som valdes i början av behandlingen.
Åldrande och cancerframkallande
Liksom vilken epigenetisk faktor som helst påverkar siRNA uttryck för gener som tystnar. Nu finns det verk som beskriver experiment för att stänga av gener associerade med tumörer. Gener slås av siRNA. Till exempel använde kinesiska forskare siRNA för att stänga av genen för transkriptionsfaktor 4 (TCF4), vars aktivitet är ansvarig för Pitt-Hopkins syndrom (en mycket sällsynt genetisk sjukdom som kännetecknas av mental retardation och episoder av hyperventilation och apné) och andra mental ohälsa. I detta arbete studerade vi TCF4: s roll i magcancerceller. Ektopisk expression av TCF4 minskar celltillväxt i magcancercellinjer och siRNA -inaktivering av TCF4 -genen ökar cellmigrationen. Således kan man dra slutsatsen att epigenetisk avstängning (tystnad) av TCF4 -genen spelar en viktig roll vid tumörbildning och utveckling.
Enligt forskning vid avdelningen för onkologi, Albert Einstein Cancer Center, ledd av Leonard H. Augenlicht, är siRNA involverat i att stänga av HDAC4 -genen, vilket orsakar hämning av tjocktarmscancer, apoptos och ökad p21 -transkription. HDAC4 är ett vävnadsspecifikt histondeacetylas som hämmar celldifferentiering och dess uttryck undertrycks under celldifferentieringsprocessen. Arbetet visade att HDAC4 är en viktig regulator för kolon cellproliferation (vilket är viktigt i cancerprocessen), och i sin tur regleras av siRNA.
Institutionen för patologi, Nara Medical University School of Medicine i Japan bedrev forskning om prostatacancer. Replikativ cellåldring är ett hinder mot okontrollerad delning och cancerframkallande. Kortlivade delande celler (TAC) är en del av prostatacellpopulationen från vilken tumörer utvecklas. Japanska forskare har studerat orsakerna till att dessa celler övervinner åldrandet. JunB siRNA transfekterades in i prostataceller i odling. I dessa celler finns det en ökad expressionsnivå av p53, p21, p16 och pRb, som detekteras under åldrandet. Celler i odling som visade en reducerad p16 -nivå användes för nästa steg. Upprepad transfektion av siRNA till TAC tillät celler att undvika åldrande när p16 / pRb inaktiverades. Dessutom inducerar tystningen av junB proto-onkogen av junB siRNA cellinvasion. Baserat på detta drogs slutsatsen att junB är ett element för p16 och främjar cellulär åldring, vilket förhindrar TAC -malignitet. JunB är således en regulator för prostatacancer och kan vara ett mål för terapeutisk intervention. Och dess aktivitet kan regleras med siRNA.
Det är många sådana studier som genomförs. För närvarande är siRNA inte bara ett objekt, utan också ett instrument i händerna på en forskare-läkare, biolog, onkolog, gerontolog. Studien av sambandet mellan siRNA och onkologiska sjukdomar, med uttryck av åldersassocierade gener är den viktigaste uppgiften för vetenskapen. Mycket lite tid har gått sedan upptäckten av siRNA, och hur många intressanta studier och publikationer som har samband med dem har dykt upp. Det råder ingen tvekan om att deras studie kommer att bli ett av mänsklighetens steg för att besegra cancer och åldrande ...
Forskare tror att det felaktiga uttrycket av små RNA är en av orsakerna till ett antal sjukdomar som mycket allvarligt påverkar hälsan hos många människor runt om i världen. Bland sådana sjukdomar finns kardiovaskulär 23 och cancer 24. När det gäller det senare är detta inte förvånande: cancer vittnar om abnormiteter i cellutvecklingen och deras öde, och små RNA spelar en viktig roll i motsvarande processer. Här är ett av de mest avslöjande exemplen på den enorma effekt som små RNA har på kroppen vid cancer. Vi talar om en malign tumör, som kännetecknas av felaktigt uttryck för de gener som verkar under den ursprungliga utvecklingen av organismen, och inte under den postnatala perioden. Det är en typ av barndomshjärntumör som vanligtvis uppträder före två års ålder. Tyvärr är detta en mycket aggressiv form av cancer, och prognosen är dålig även vid intensiv behandling. Den onkologiska processen utvecklas till följd av felaktig omfördelning av genetiskt material i hjärnceller. Promotorn, som vanligtvis orsakar starkt uttryck för en av generna som kodar för proteiner, genomgår rekombination med ett specifikt kluster av små RNA. Då förstärks hela denna omarrangerade region: med andra ord skapas många kopior av den i genomet. Följaktligen uttrycks små RNA som ligger "nedströms" än den förskjutna promotorn mycket starkare än de borde. Nivån av innehållet i aktivt litet RNA är cirka 150-1000 gånger högre än normen.
Ris. 18.3. Små RNA aktiverade av alkohol kan binda till budbärar -RNA som inte påverkar kroppens motståndskraft mot alkohol. Men dessa små RNA binder inte till messenger -RNA -molekyler som bidrar till detta motstånd. Detta leder till en relativ övervägande andel av messenger -RNA -molekyler som kodar för proteinvariationer associerade med alkoholresistens.
Detta kluster kodar över 40 olika små RNA. Egentligen är detta i allmänhet det största av sådana kluster som finns i primater. Det uttrycks vanligtvis först i ett tidigt skede av mänsklig utveckling, under de första 8 veckorna av ett embryos liv. Dess starka aktivering i spädbarnets hjärna leder till en katastrofal effekt på genetiskt uttryck. En av konsekvenserna är uttrycket av ett epigenetiskt protein som lägger till modifieringar av DNA. Detta leder till storskaliga förändringar i hela mönstret av DNA-metylering, och därför till onormalt uttryck för alla typer av gener, av vilka många endast måste uttryckas när omogna hjärnceller delar sig under de tidiga stadierna av kroppens utveckling. Så här startar cancerprogrammet 25 i barnets celler.
Sådan kommunikation mellan små RNA och den cellens epigenetiska apparat kan ha en signifikant effekt på andra situationer när en predisposition för cancer utvecklas i celler. Denna mekanism leder förmodligen till att effekten av nedsatt uttryck av små RNA förstärks genom att förändra epigenetiska modifieringar som överförs till dotterceller från modern. Detta är hur ett schema med potentiellt farliga förändringar i karaktären av genuttryck kan bildas.
Hittills har forskare inte räknat ut alla stadier av interaktionen mellan små RNA och epigenetiska processer, men de lyckas ändå få några antydningar om funktionerna i det som händer. Till exempel visade det sig att en viss klass av små RNA som ökar aggressiviteten hos bröstcancer riktar sig mot vissa enzymer i budbärar -RNA som tar bort viktiga epigenetiska modifieringar. Detta förändrar mönstret för epigenetiska modifieringar i cancercellen och stör ytterligare genetiskt uttryck 26.
Många former av cancer är svåra att spåra hos en patient. Onkologiska processer kan äga rum på svåråtkomliga platser, vilket försvårar provtagningsproceduren. I sådana fall är det svårt för läkaren att övervaka utvecklingen av cancerprocessen och svaret på behandlingen. Ofta tvingas läkare att förlita sig på indirekta mätningar - säg en tomografisk skanning av en tumör. Vissa forskare tror att små RNA -molekyler kan hjälpa till att skapa en ny metod för övervakning av tumörutveckling, vilket också gör det möjligt att studera dess ursprung. När cancerceller dör lämnar små RNA celler när de brister. Dessa små skräpmolekyler bildar ofta komplex med cellulära proteiner eller inslagna i fragment cellmembran... Detta gör dem mycket stabila i flytande media organism, vilket innebär att sådant RNA kan isoleras och analyseras. Eftersom deras antal är små måste forskare använda mycket känsliga analysmetoder. Inget är dock omöjligt här: känsligheten för nukleinsyrasekvensering ökar ständigt 27. Data har publicerats som bekräftar löftet om detta tillvägagångssätt för bröstcancer 28, äggstockscancer 29 och ett antal andra cancerformer. Analys av små cirkulerande RNA hos lungcancerpatienter har visat att dessa RNA hjälper till att skilja mellan patienter med en enda lungknöl (som inte kräver behandling) och patienter som utvecklar maligna tumörknutor (kräver behandling) 30.
I en levande cell torkar aldrig informationsflödet mellan kärnan och cytoplasman, men att förstå alla dess "virvlar" och avkoda informationen som är kodad i den är en verkligt titanisk uppgift. Ett av de viktigaste genombrotten inom biologin under det senaste århundradet kan betraktas som upptäckten av molekyler av informativt (eller matris) RNA (mRNA eller mRNA), som fungerar som medlare och överför informativa "meddelanden" från kärnan (från kromosomer) till cytoplasman. RNA: s avgörande roll för proteinsyntes förutspåddes redan 1939 i Torbjörn Kasperssons arbete ( Torbjörn Caspersson), Jean Brachet ( Jean brachet) och Jack Schultz ( Jack schultz) och 1971 George Marbeis ( George marbaix) startade syntesen av hemoglobin i groda -oocyter genom att injicera det första isolerade kaninbudet RNA som kodar detta protein.
1956-1957 i Sovjetunionen bevisade A. N. Belozersky och A. S. Spirin oberoende att mRNA finns, och fick också reda på att huvuddelen av RNA i en cell inte alls är matris, utan ribosomalt RNA(rRNA). Ribosomalt RNA - den andra "huvudsakliga" typen av cellulärt RNA - bildar "skelett" och funktionellt centrum för ribosomer i alla organismer; det är rRNA (och inte proteiner) som reglerar de viktigaste stadierna av proteinsyntes. Samtidigt beskrevs och studerades den tredje "huvudsakliga" typen av RNA - transport -RNA (tRNA), som i kombination med två andra - mRNA och rRNA - bildar ett enda proteinsyntetiserande komplex. Enligt den ganska populära hypotesen om "RNA -världen" är det detta nukleinsyra låg i själva livets ursprung på jorden.
På grund av att RNA är mycket mer hydrofilt än DNA (på grund av att deoxiribos ersätts med ribos) är det mer labilt och kan röra sig relativt fritt i cellen och levererar därför kortlivade kopior av genetisk information (mRNA) till platsen där den börjar proteinsyntes. Det är dock värt att notera de "besvär" som är förknippade med detta - RNA är mycket instabilt. Det är mycket värre än DNA, det lagras (även inuti cellen) och försämras vid minsta förändring av förhållanden (temperatur, pH). Förutom "egen" instabilitet tillhör ett stort bidrag ribonukleaser (eller RNaser) - en klass av RNA -klyvande enzymer som är mycket stabila och "allestädes närvarande" - även huden på försökspersonens händer innehåller tillräckligt med dessa enzymer för att negera hela experimentet. På grund av detta är arbetet med RNA mycket svårare än med proteiner eller DNA - det senare kan i allmänhet lagras i hundratusentals år med liten eller ingen skada.
Fantastisk noggrannhet på jobbet, tridistilat, sterila handskar, engångsglasglas - allt detta är nödvändigt för att förhindra nedbrytning av RNA, men efterlevnad av sådana standarder var inte alltid möjligt. Därför ignorerades helt enkelt de korta "fragmenten" av RNA, som oundvikligen kontaminerade lösningar. Men med tiden blev det klart att, trots alla ansträngningar för att upprätthålla arbetsområdet sterilitet, fortsatte naturligtvis "skräpet" att hittas, och sedan visade det sig att det alltid finns tusentals korta dubbelsträngade RNA i cytoplasma som utför ganska specifika funktioner och är absolut nödvändiga för normala utvecklingsceller och organismer.
RNA -störningsprincip
Apotekare är också intresserade av möjligheten att använda siRNA, eftersom förmågan att rikta regleringen av enskilda gener fungerar lovar oöverträffade möjligheter vid behandling av en mängd olika sjukdomar. Liten storlek och hög verkningsspecificitet lovar hög effekt och låg toxicitet av siRNA-baserade läkemedel; dock lösa problemet leverans siRNA för sjuka celler i kroppen har ännu inte varit framgångsrik - detta beror på dessa molekylers skörhet och skörhet. Och även om nu dussintals lag försöker hitta ett sätt att rikta dessa "magiska kulor" exakt mot målet (inuti sjuka organ), har de ännu inte uppnått synlig framgång. Dessutom finns det andra komplikationer. Till exempel, när det gäller antiviral terapi, kan den höga selektiviteten av siRNA: s verkan vara en "björntjänst" - eftersom virus muterar snabbt, kommer den förändrade stammen mycket snabbt att tappa känsligheten för siRNA som valts i början av behandlingen: det är känt att byte av endast en nukleotid i siRNA leder till en signifikant minskning av störningseffekt.
Vid denna tidpunkt är det värt att återkalla - siRNA upptäcktes bara i växter, ryggradslösa djur och encelliga; även om homologer av proteiner för RNA -interferens (Dicer, RISC -komplex) också finns i högre djur, detekterades inte siRNA med konventionella metoder. Vad var överraskningen när artificiellt introducerad syntetiska siRNA-analoger orsakade en stark specifik dosberoende effekt i cellkulturer hos däggdjur! Detta innebar att i ryggradsdjurceller ersattes inte RNA -interferens med mer komplexa immunsystem, utan utvecklades tillsammans med organismer och blev något mer "avancerat". Följaktligen var det hos däggdjur nödvändigt att inte leta efter exakta analoger av siRNA, utan efter deras evolutionära efterträdare.
Spelare 2 - mikroRNA
På grundval av en evolutionärt ganska gammal mekanism för RNA -störning i mer utvecklade organismer har två specialiserade system för kontroll av genernas arbete dykt upp, var och en med sin egen grupp av små RNA - mikroRNA(microRNA) och piRNA(piRNA, Piwi-interagerande RNA). Båda systemen uppträdde i svampar och coelenterater och utvecklades tillsammans med dem, som förträngde siRNA och mekanismen för "naken" RNA -störning. Deras roll för att tillhandahålla immunitet minskar, eftersom denna funktion togs över av mer avancerade mekanismer för cellulär immunitet, i synnerhet interferonsystemet. Detta system är dock så känsligt att det fungerar på siRNA själv: utseendet på små dubbelsträngade RNA i däggdjursceller utlöser ett "larm" (aktiverar utsöndringen av interferon och orsakar uttryck av interferonberoende gener, vilket blockerar all translation processer helt). I detta avseende förmedlas mekanismen för RNA -interferens hos högre djur huvudsakligen av mikroRNA och piRNA - enkelsträngade molekyler med en specifik struktur som inte detekteras av interferonsystemet.
När genomet blev mer komplext blev mikroRNA och piRNA alltmer involverade i regleringen av transkription och translation. Med tiden utvecklades de till ett ytterligare, exakt och subtilt system för genomreglering. Till skillnad från siRNA produceras inte miRNA och piRNA (upptäcktes 2001, se ruta 3) från främmande dubbelsträngade RNA-molekyler, utan kodas initialt i värdgenomet.
Möt: microRNA
MiRNA -prekursorn transkriberas från båda strängarna av genomiskt DNA med RNA -polymeras II, vilket resulterar i att en mellanliggande form uppträder - pri -miRNA - som bär egenskaperna hos vanligt mRNA - m 7 G -cap och polyA -tail. I denna föregångare bildas en slinga med två enkelsträngade "svansar" och flera oparade nukleotider i mitten (fig. 3). En sådan slinga genomgår tvåstegsbehandling (Fig. 4): För det första skär Drosha-endonukleaset av enkelsträngade RNA-"svansar" från hårnålen, varefter den klippta hårnålen (pre-mikroRNA) exporteras till cytoplasman, där den känns igen av Dicer, som gör ytterligare två snitt (en dubbelsträngad sektion skärs ut färgkodad i fig. 3). I denna form ingår moget mikroRNA, på samma sätt som siRNA, i RISC -komplexet.
Figur 3. Strukturen för en dubbelsträngad mikroRNA-prekursormolekyl. Huvuddrag: förekomsten av konservativa sekvenser som bildar en hårnål; närvaron av en komplementär kopia (miRNA *) med två "extra" nukleotider vid 3' -änden; en specifik sekvens (2–8 bp) som bildar en igenkänningsplats för endonukleaser. Själva mikroRNA är markerat med rött - det är vad Dicer skär ut.
Verkningsmekanismen för många miRNA liknar den för siRNA: ett kort (21–25 nukleotider) enkelsträngat RNA i RISC-proteinkomplexet binder med hög specificitet till ett komplementärt ställe i 3 'otranslaterade regionen av mål-mRNA. Bindning resulterar i klyvning av mRNA av Ago -proteinet. Aktiviteten för mikroRNA (jämfört med siRNA) är dock redan mer differentierad - om komplementariteten inte är absolut kan mål -mRNA inte brytas ned, utan bara blockeras reversibelt (det blir ingen translation). Samma RISC -komplex kan också användas artificiellt introducerad siRNA. Detta förklarar varför siRNA gjorda i analogi med protozoer också är aktiva hos däggdjur.
Således kan vi komplettera illustrationen av verkningsmekanismen för RNA -interferens i högre (bilateralt symmetriska) organismer genom att i en figur kombinera handlingsschemat för mikroRNA och biotekniskt introducerade siRNA (fig. 5).
Figur 5. Generaliserat verkningsschema för artificiellt mikroRNA och siRNA(artificiella siRNA introduceras i cellen med hjälp av specialiserade plasmider - inriktning siRNA -vektor).
Funktioner av mikroRNA
Fysiologiska funktioner hos mikroRNA är extremt olika - i själva verket fungerar de som de viktigaste icke -proteinregulatorerna för ontogenes. miRNA avbryter inte, utan kompletterar det "klassiska" schema för genreglering (inducerare, suppressorer, kromatinkomprimering, etc.). Dessutom regleras syntesen av miRNA själva på ett komplext sätt (vissa pooler av miRNA kan aktiveras av interferoner, interleukiner, tumörnekrosfaktor α (TNF-α) och många andra cytokiner). Som ett resultat växer ett nätverk med flera nivåer för att ställa in "orkestern" för tusentals gener, fantastiskt i sin komplexitet och flexibilitet, fram, men detta slutar inte heller där.
mikroRNA är mer "universella" än siRNA: "avdelnings" -gener behöver inte vara 100% komplementära - reglering utförs även med partiell interaktion. Idag är ett av de hetaste ämnena inom molekylärbiologi sökandet efter mikroRNA som fungerar som alternativa regulatorer av kända fysiologiska processer. Till exempel har miRNA som är involverade i regleringen av cellcykeln och apoptos i växter, Drosophila och nematoder redan beskrivits; hos människor reglerar mikroRNA immunsystemet och utvecklingen av hematopoetiska stamceller. Användningen av teknik baserad på biochips (mikro-array screening) har visat att hela pooler av små RNA slås på och av vid olika stadier av cellliv. För biologiska processer har dussintals specifika mikroRNA identifierats, vars uttrycksnivå ändras tusentals gånger under vissa förhållanden, vilket betonar den exceptionella kontrollerbarheten hos dessa processer.
Fram till nyligen trodde man att mikroRNA endast undertrycker - helt eller delvis - genernas arbete. Men nyligen visade det sig att effekten av mikroRNA kan vara radikalt olika beroende på cellens tillstånd! I en aktivt delande cell hämmar mikroRNA, som har bundit sig till den komplementära sekvensen i 3' -regionen av mRNA, proteinsyntes (translation). Men i viloläge eller stress (till exempel när man växer i en dålig miljö) leder samma händelse till exakt motsatt effekt - en ökning av syntesen av målproteinet!
Utveckling av mikroRNA
Antalet mikroRNA -sorter i högre organismer har ännu inte fastställts fullt ut - enligt vissa data överstiger det 1% av antalet proteinkodande gener (till exempel talar de om 700 mikroRNA, och detta antal är konstant växande). MikroRNA reglerar aktiviteten för cirka 30% av alla gener (mål för många av dem är ännu inte kända), och det finns både allestädes närvarande och vävnadsspecifika molekyler - till exempel reglerar en sådan viktig pool av mikroRNA mognad av blodstamceller .
Den breda uttrycksprofilen i olika vävnader hos olika organismer och den biologiska förekomsten av mikroRNA indikerar ett evolutionärt uråldrigt ursprung. För första gången upptäcktes miRNA i nematoder, och under lång tid trodde man att dessa molekyler endast förekommer i svampar och coelenterat; de upptäcktes dock senare även i encelliga alger. Intressant nog, när organismer blir mer komplexa, ökar också mängden och heterogeniteten i mikroRNA -poolen. Detta indirekt indikerar att komplexiteten hos dessa organismer särskilt tillhandahålls av funktionen av mikroRNA. Den möjliga utvecklingen av mikroRNA visas i figur 6.
Figur 6. Mångfald av mikroRNA i olika organismer. Ju högre organism organisationen är, desto mer mikroRNA finns i den (antalet inom parentes). Arter är markerade med rött, där enda mikroRNA.
Ett tydligt evolutionärt förhållande kan dras mellan siRNA och mikroRNA, baserat på följande fakta:
- verkan av båda typerna är utbytbar och medieras av homologa proteiner;
- siRNA som introduceras i däggdjursceller specifikt "stänger av" de önskade generna (trots viss aktivering av interferonförsvar);
- mikroRNA finns i allt fler gamla organismer.
Dessa och andra data tyder på att båda systemen kommer från en gemensam "förfader". Det är också intressant att notera att "RNA" -immunitet som en oberoende föregångare till proteinantikroppar bekräftar teorin om ursprunget till de första livsformerna baserat på RNA, inte proteiner (kom ihåg att detta är favoritteorin för Academician AS.Spirin).
Ju längre, desto mer förvirrande. Spelare # 3 - piRNA
Även om det bara fanns två "spelare" på arenan för molekylärbiologi - siRNA och mikroRNA - verkade huvudsyftet med "RNA -störningar" vara helt klart. Faktiskt: en uppsättning homologa korta RNA och proteiner i olika organismer utför liknande åtgärder; i takt med att organismer blir mer komplexa blir funktionaliteten mer komplex.
Men under utvecklingsprocessen skapade naturen ett annat, evolutionärt det senaste och högspecialiserade systemet baserat på samma framgångsrika RNA -interferens. Vi pratar om piRNA (piRNA, från Piwi-interaktion RNA).
Ju mer komplext genomet är organiserat, desto mer utvecklad och anpassad organism (eller tvärtom? ;-). Den ökande komplexiteten hos genomet har dock också en baksida: det komplexa genetiska systemet blir instabil... Detta leder till behovet av mekanismer som är ansvariga för att upprätthålla genomets integritet - annars kommer spontan "blandning" av DNA helt enkelt att inaktivera det. Mobila genetiska element ( IGE) - en av huvudfaktorerna för genominstabilitet - är korta instabila regioner som kan autonomt transkriberas och migreras genom genomet. Aktiveringen av sådana mobila element leder till flera DNA -brytningar i kromosomer, fyllda med dödliga konsekvenser.
Antalet SHE ökar olinjärt med genomets storlek och deras aktivitet måste innehållas. För detta använder djur, som börjar med coelenterates, samma fenomen av RNA -störning. Denna funktion utförs också av korta RNA, dock inte de vi redan har diskuterat, utan deras tredje typ, piRNA.
"Porträtt" av piRNA
PiRNA -funktioner
Huvudfunktionen för piRNA är att undertrycka MGE -aktiviteten vid transkription och translation. Man tror att piRNA endast är aktiva under embryogenes, när oförutsägbar blandning av genomet är särskilt farligt och kan leda till att embryot dör. Detta är logiskt - när immunsystemet ännu inte har börjat fungera behöver embryonets celler ett enkelt men effektivt skydd. Embryot skyddas på ett tillförlitligt sätt mot yttre patogener av moderkakan (eller äggskalet). Men förutom detta behövs också försvar mot endogena (interna) virus, främst MGE.
Denna roll som piRNA har bekräftats av erfarenhet - "knockout" eller mutationer av Ago3-, Piwi- eller Aub -generna leder till allvarliga utvecklingsstörningar (och en kraftig ökning av antalet mutationer i genomet hos en sådan organism), och orsakar också infertilitet på grund av försämrad utveckling av könsceller.
Distribution och utveckling av piRNA
De första piRNA finns redan i anemoner och svampar. Växter tog tydligen en annan väg - Piwi -proteiner hittades inte i dem, och endonukleaset Ago4 och siRNA spelar rollen som en nosparti för transposoner.
Hos högre djur, inklusive människor, är piRNA -systemet mycket välutvecklat, men det kan bara hittas i embryonala celler och i fostrets endotel. Varför distributionen av piRNA i kroppen är så begränsad återstår att se. Det kan antas att, precis som alla kraftfulla vapen, piRNA är fördelaktiga endast under mycket specifika förhållanden (under fosterutveckling), och i den vuxna kroppen kommer deras aktivitet att göra mer skada än nytta. Ändå är antalet piRNA en storleksordning större än antalet kända proteiner, och det är svårt att förutsäga de ospecifika effekterna av piRNA i mogna celler.
| siRNA | mikroRNA | piRNA | |
|---|---|---|---|
| Spridning | Växter, Drosophila, C. elegans... Finns inte hos ryggradsdjur | Eukaryoter | Embryonala celler hos djur (med början med coelenterat). Inga protozoer och växter |
| Längd | 21-22 nukleotider | 19-25 nukleotider | 24-30 nukleotider |
| Strukturera | Dubbelsträngade, 19 komplementära nukleotider och två oparade nukleotider vid 3'-änden | Ensträngad komplex struktur | Ensträngad komplex struktur. U vid 5'-slutet, 2'- O-metylerad 3'-ände |
| Bearbetning | Dicer-beroende | Dicer-beroende | Dicer-oberoende |
| Endonukleas | Sedan 2 | Sedan 1, sedan 2 | Ago3, Piwi, Aub |
| Aktivitet | Nedbrytning av komplementärt mRNA, acetylering av genomiskt DNA | Nedbrytning eller hämning av translation av mål -mRNA | Nedbrytning av mRNA som kodar MGE, reglering av MGE -transkription |
| Biologisk roll | Antiviralt immunförsvar, undertryckande av aktiviteten hos egna gener | Reglering av genaktivitet | Undertryckning av MGE -aktivitet under embryogenes |
Slutsats
Avslutningsvis skulle jag vilja ge en tabell som illustrerar utvecklingen av proteinapparaten som är involverad i RNA -interferens (fig. 9). Det kan ses att protozoer har det mest utvecklade siRNA -systemet (proteinfamiljer sedan, Dicer), och när organismer blir mer komplexa flyttas tyngden till mer specialiserade system - antalet proteinisoformer för mikroRNA (Drosha, Pasha) och piRNA (Piwi, Hen1) ökar. Samtidigt minskar variationen av enzymer som medierar verkan av siRNA.
Figur 9. Mångfald av proteiner involverade i RNA -interferens(siffrorna anger mängden proteiner i varje grupp). I blått element som är karakteristiska för siRNA och mikroRNA markeras, och röd- protein och associerad med piRNA.
Fenomenet RNA -störning har redan börjat användas av de enklaste organismerna. På grundval av denna mekanism har naturen skapat en prototyp av immunsystemet, och i takt med att organismer blir mer komplexa blir RNA -störningar en oumbärlig regulator av genomaktivitet. Två olika mekanismer plus tre typer av korta RNA ( centimeter. flik. 1) - som ett resultat ser vi tusentals subtila regulatorer av olika metaboliska och genetiska vägar. Denna slående bild illustrerar mångsidigheten och evolutionära anpassningen av molekylär biologiska system... Korta RNA bevisar återigen att det inte finns några "små saker" inuti cellen - det finns bara små molekyler, vars betydelse för rollen vi precis har börjat förstå.
(Det är sant att en sådan fantastisk komplexitet snarare talar om att evolutionen är "blind" och fungerar utan en förgodkänd "allmän plan";
Små RNA som bildar hårnålar eller korta RNA som bildar hårnålar (shRNA kort hårnål RNA, små hårnåls -RNA) är korta RNA -molekyler som bildar täta hårnålar i den sekundära strukturen. ShRNA kan användas för att stänga av uttryck ... ... Wikipedia
RNA -polymeras- från en T. aquaticus -cell under replikering. Vissa element i enzymet görs transparenta och RNA- och DNA -strängarna syns tydligare. Magnesiumjonen (gul) är belägen vid enzymets aktiva plats. RNA -polymeras är ett enzym som utför ... ... Wikipedia
RNA -störning- Leverans av små RNA innehållande hårnålar med hjälp av en vektor baserad på lentivirus och mekanismen för RNA -störning i däggdjursceller RNA -störning (en ... Wikipedia
RNA -gen- Icke-kodande RNA (ncRNA) är RNA-molekyler som inte översätts till proteiner. Den tidigare använda synonymen, små RNA (smRNA, små RNA), används för närvarande inte, eftersom vissa icke-kodande RNA kan vara mycket ... ... Wikipedia
Små kärn -RNA- (snRNA, snRNA) En klass av RNA som finns i kärnan i eukaryota celler. De transkriberas av RNA -polymeras II eller RNA -polymeras III och är involverade i viktiga processer som splitsning (avlägsnande av introner från omoget mRNA), reglering ... Wikipedia
Små nukleolära RNA- (snoRNA, engelska snoRNA) en klass av små RNA som är involverade i kemiska modifieringar (metylering och pseudouridylering) av ribosomala RNA, samt tRNA och små kärn -RNA. Enligt MeSH -klassificeringen betraktas små nukleolära RNA som en undergrupp ... ... Wikipedia
litet kärnkraftigt (lågmolekylärt kärn -RNA)- En omfattande grupp (105 106) av små kärn -RNA (100 300 nukleotider), associerade med heterogen kärn -RNA, är en del av kärnans små ribonukleoproteingranuler; M.Ya.RNA är en nödvändig komponent i skarvningssystemet ... ...
litet cytoplasmatiskt RNA- Små (100-300 nukleotider) RNA-molekyler lokaliserade i cytoplasman, liknande små kärn-RNA. [Arefiev V.A., Lisovenko L.A. Engelska ryska förklarande ordbok genetiska termer 1995 407s.] Genetema EN scyrpssmå cytoplasmatisk ... ... Teknisk översättarguide
liten nukleär RNA klass U- En grupp protein-associerade små (från 60 till 400 nukleotider) RNA-molekyler som utgör en betydande del av det skarvade innehållet och deltar i processen med intron excision; 4 av 5 välstuderade typer av Usn RNA U1, U2, U4 och U5 har 5 ... ... Teknisk översättarguide
RNA -biomarkörer- * RNA -biomarkörer * RNA -biomarkörer stor mängd mänskliga transkript som inte kodar för proteinsyntes (nsbRNA eller npcRNA). I de flesta fall är små (miRNA, snoRNA) och långa (antisense RNA, dsRNA och andra typer) RNA -molekyler ... ... Genetik. encyklopedisk ordbok
Böcker
- Köp för 1877 UAH (endast Ukraina)
- Klinisk genetik. Lärobok (+ CD), Bochkov Nikolay Pavlovich, Puzyrev Valery Pavlovich, Smirnikhina Svetlana Anatolyevna. Alla kapitel har reviderats och kompletterats i samband med utvecklingen av medicinsk vetenskap och praktik. Kapitel om multifaktoriella sjukdomar, förebyggande, behandling av ärftliga sjukdomar, ...
), förhindrar translation av mRNA på ribosomer till det protein som kodas av det. I slutändan är effekten av små störande RNA identiska med den om genuttryck helt enkelt minskade.
Små störande RNA upptäcktes 1999 av David Baulcombes grupp i Storbritannien som en komponent i det post-transkriptionella genavstängningssystemet i växter. PTGS, sv: post-transkriptionell genavstängning). Gruppen publicerade resultaten i tidskriften Science.
Dubbelsträngade RNA kan förbättra genuttryck genom en mekanism som kallas RNA-beroende genaktivering. RNAa, liten RNA-inducerad genaktivering). Det har visats att dubbelsträngade RNA som komplementerar till promotorerna för målgener orsakar aktivering av motsvarande gener. RNA-beroende aktivering med introduktion av syntetiskt dubbelsträngat RNA har visats i humana celler. Det är inte känt om ett liknande system finns i cellerna hos andra organismer.
Genom att ge möjlighet att stänga av i princip vilken gen som helst, har RNA -interferens baserat på små störande RNA genererat ett enormt intresse för grundläggande och tillämpad biologi. Antalet utbredda RNA -interferensprov för att identifiera viktiga gener i biokemiska vägar växer ständigt. Eftersom sjukdomsprogression också drivs av genaktivitet förväntas det i vissa fall att stänga av en gen med små interfererande RNA kan ha en terapeutisk effekt.
Emellertid möter tillämpningen av RNA -interferens baserad på små störande RNA på djur, och i synnerhet på människor, många svårigheter. Experiment har visat att effektiviteten hos små interfererande RNA är olika för olika typer av celler: vissa celler reagerar lätt på effekterna av små störande RNA och visar en minskning av genuttryck, medan det i andra inte observeras, trots effektiv transfektion. Orsakerna till detta fenomen är fortfarande dåligt förstådda.
Resultaten av den första fasen av försök med de två första terapeutiska läkemedlen som verkar på RNA -interferensmekanismen (avsedd för behandling av makuladegeneration), publicerade i slutet av 2005, visar att läkemedel baserade på små interfererande RNA lätt tolereras av patienter och har acceptabla farmakokinetiska egenskaper.
Preliminära kliniska prövningar av små interfererande RNA riktade mot ebolaviruset indikerar att de kan vara effektiva för profylax efter exponering av sjukdomen. Detta läkemedel tillät hela gruppen av experimentella primater att överleva, som fick en dödlig dos av Zaire Ebolavirus
