Cinetica reacțiilor enzimatice. Dependența vitezei reacțiilor enzimatice de concentrația substraturilor, enzimelor, temperatură Care este ordinea reacției enzimatice pe enzime

Viteza reacțiilor enzimatice depinde de concentrația sub-

strat. Această dependență este complexă, ceea ce pentru anumite enzime este descrisă printr-o curbă parabolică (Fig. 29).

Figura 29 – Dependența vitezei de reacție enzimatică

asupra concentrației substratului

Natura parabolica a dependentei se explica prin faptul ca atunci cand enzima interactioneaza cu substratul, se formeaza un complex enzima-substrat. Inițial, pe măsură ce concentrația de substrat crește, crește concentrația de complexe enzimă-substrat în amestecul de reacție, ceea ce se manifestă printr-o creștere paralelă a vitezei de reacție. La o anumită concentrație a substratului (saturare), are loc un fel de „saturare” a tuturor centrilor activi ai moleculelor de enzime din amestecul de reacție. Viteza reacției enzimatice la concentrație de saturare devine maximă. Odată cu o creștere suplimentară a conținutului de substrat din amestecul de reacție, acesta nu se modifică.

Din graficul dependenței vitezei unei reacții enzimatice de concentrația substratului, se calculează doi indicatori importanți:

1. Viteza maximă de reacție (V max). Este definită ca viteza de reacție la concentrația de saturare a substratului. Valoarea vitezei maxime reflectă puterea catalitică a enzimei. Enzime mai mari V max sunt catalizatori mai puternici. Ele catalizează transformarea unui număr mai mare de molecule de substrat pe unitatea de timp. Viteza maximă este exprimată prin numărul de rotații ale enzimei. Cifra de afaceri este estimată prin numărul de molecule de substrat convertite de enzimă pe unitatea de timp (s -1). Pentru majoritatea enzimelor, cifra de afaceri este de 104. În același timp, există enzime pentru care viteză semnificativ mai mare (600.000 pentru carbanhidrază) sau mai mică decât această valoare (100 pentru chimotripsină).

2. Michaelis constantă (LA m). Constanta Michaelis este concentrația de substrat la care viteza de reacție este jumătate maximă. Magnitudinea LA m reflectă afinitatea enzimei pentru substrat. Cu cât această valoare este mai mare, cu atât mai puțină afinitate are enzima pentru substrat. LA m este exprimat în moli de substrat. Deci, valoarea LA m în raport cu glucoza pentru enzima glucokinază este de 10 mmol, iar pentru hexokinază - 0,01 mmol. Hexokinaza prezintă o afinitate mai mare pentru glucoză decât glucokinaza la aceeași concentrație de substrat, catalizează fosforilarea glucozei la o rată mai mare.

Pe baza unei analize matematice a curbei dependenței vitezei unei reacții enzimatice de concentrația substratului, L. Michaelis și M. Menten (1913) au derivat o formulă care permite evaluarea relației dintre viteza de reacție, rata maximă și constanta Michaelis. În prezent este definită ca ecuația Michaelis–Menten.

V o = V max [ S]/K m + [ S],

Unde V o – viteza de reacție, S– concentrația substratului.

Proprietățile generale ale enzimelor

În ciuda existenței unor diferențe de structură, funcție și localizare intracelulară, enzimele se caracterizează printr-o serie de proprietăți comune. Acestea includ dependența manifestării activității lor catalitice de temperatură (labilitatea termică) și pH-ul mediului, precum și specificitatea substratului.

O proprietate caracteristică a enzimelor este termolabilitatea. Acest fenomen poate fi ilustrat printr-un grafic al vitezei unei reacții enzimatice în funcție de temperatura amestecului de reacție (Fig. 30).

Figura 30 – Dependența vitezei de reacție enzimatică de temperatură

mediu de reacție ( t opt – temperatura optima; V- viteza de reactie)

După cum se poate observa din graficul prezentat, la o temperatură apropiată de 4 o C, reacțiile enzimatice practic nu au loc. Din acest motiv, obiectele biologice pot fi depozitate la rece pentru un anumit timp înainte de a efectua studii biochimice. Este frigul care permite conservarea produselor alimentare de la autoliză (autodigestie).

O creștere a temperaturii este însoțită de o creștere a vitezei reacției enzimatice. Motivul pentru aceasta este o creștere a energiei cinetice a substratului și a moleculelor de enzime, ceea ce crește rata de interacțiune între ele. Un fenomen similar se observă până la o temperatură care corespunde temperaturii optime a enzimei. Temperatura optimă a enzimei corespunde temperaturii la care viteza reacției enzimatice este maximă. Pentru enzimele animalelor cu sânge cald este de obicei 28 o C sau 37 o C.

O creștere suplimentară a temperaturii amestecului de reacție conduce la o scădere treptată a vitezei reacției enzimatice. Acest fenomen se datorează procesului de denaturare termică a lanțului polipeptidic proteic. Denaturarea este însoțită de o modificare a structurii centrului activ al enzimei, ceea ce are ca rezultat o scădere a afinității enzimei pentru substrat. La temperaturi peste 55 o C, majoritatea enzimelor își pierd complet proprietățile catalitice (inactivate). În acest sens, încălzirea la 55–56 o C este utilizată pe scară largă pentru procedura de pasteurizare, care crește durata de valabilitate a produselor alimentare (lapte etc.).

pH-ul mediului are o mare influență asupra vitezei reacției enzimatice. După cum se poate observa din figura prezentată. 31 grafic, seamănă în formă cu un grafic al dependenței vitezei unei reacții enzimatice de temperatură.

Figura 31 – Dependența de viteză ( V) reacție enzimatică

asupra pH-ului mediului (pH opt – pH optim al enzimei)

O scădere bruscă a vitezei de reacție enzimatică la valori extreme ale pH-ului este asociată cu fenomenul de denaturare a lanțului polipeptidic al unei molecule de proteine ​​sub influența acizilor și alcalinelor. Enzima prezintă putere catalitică maximă la o valoare a pH-ului, care este determinată de termen pH optim enzimă. Cele mai multe enzime cunoscute au un pH optim în intervalul de la 5,0 la 7,5. În același timp, există multe exemple de enzime în care valoarea optimă a pH-ului este deplasată în regiunea valorilor pH acide sau alcaline. Aceste enzime includ:

Motivul existenței unei dependențe a vitezei reacțiilor enzimatice de pH se datorează faptului că valoarea pH-ului mediului are un efect pronunțat asupra gradului de ionizare a grupărilor funcționale ale substratului. Caracteristici ale ionizării moleculei de acid succinic la aciditate diferită a mediului (pH):

În același timp, pH-ul mediului afectează și gradul de ionizare al radicalilor de aminoacizi care alcătuiesc centrul activ al enzimei:

Dacă formarea complexului enzimă-substrat este stabilizată datorită interacțiunilor electrostatice, atunci rolul pH-ului în asigurarea condițiilor optime pentru desfășurarea reacției enzimatice devine clar (Fig. 24).

Viteza reacțiilor catalizate de enzime, în a căror interacțiune cu substraturile interacțiunile electrostatice nu sunt semnificative, depinde într-o măsură mai mică de pH-ul mediului. În fig. Figura 32 arată dependența ratei de hidroliză a proteinei de către papaină. În interacțiunea acestei enzime cu substratul, interacțiunile hidrofobe devin de importanță primordială. După cum se poate observa din graficul prezentat, papaina, în general, nu are un pH optim clar definit.

Figura 32 - Efectul pH-ului asupra vitezei de hidroliză a proteinei de către papaină.

Enzimele au o anumită specificitate referitor la substraturi. Specificitatea se referă la capacitatea enzimelor de a cataliza transformarea unuia sau a unui grup de substraturi similare structural. Există mai multe tipuri de specificitate enzimatică.

· Specificitate absolută. Se referă la capacitatea unei enzime de a cataliza transformarea unui singur substrat. Enzimele cu specificitate absolută includ arginaza, enzimele de restricție a uricazei etc.

· Specificitate relativă. Înseamnă capacitatea unei enzime de a cataliza transformarea unui grup de substraturi asemănătoare ca structură (așa-numitele enzime proteolitice hidrolizează diverse proteine, esterii lipază ai glicerolului și acizii grași superiori, hexokinaza fosforilează diverse monozaharide). În acest caz, specificitatea este determinată de faptul că enzima afectează doar un anumit tip de legătură (enzimele proteolitice hidrolizează legătura peptidică, lipaza hidrolizează legătura esterică etc.).

· Stereospecificitate . Acest termen se referă la capacitatea unei enzime de a cataliza conversia unui stereoizomer al unui substrat. Astfel, enzimele implicate în conversia monozaharidelor prezintă specificitate în raport cu acestea D-stereoizomerii, și enzimele implicate în transformarea aminoacizilor - în lor L-stereo-izomeri.

Activitatea enzimatică

Particularitatea enzimelor ca catalizatori este că sunt capabile să-și schimbe proprietățile catalitice sub influența diverșilor factori externi. O măsură a puterii acțiunii catalitice a enzimelor este lor activitate. Capacitatea enzimelor de a-și schimba activitatea în diferite condiții are un mare sens biologic. Această proprietate permite unei celule vii să adapteze starea proceselor metabolice la nevoile imediate ale celulelor, care se pot schimba semnificativ sub influența diferiților factori externi.

Determinarea activității enzimatice joacă un rol important în caracterizarea lor. Există câteva principii generale pentru cuantificarea activității enzimatice. Activitatea enzimatică poate fi determinată după cum urmează:

· fie prin viteza de acumulare în amestecul de reacție în care se află enzima produsului de reacție;

· sau prin viteza de dispariţie a substratului reacţiei enzimatice din amestecul de reacţie.

Ambele abordări sunt echivalente și pot fi utilizate în practică. Cu toate acestea, la determinarea activității enzimatice, trebuie respectate următoarele condiții: în amestecul de reacție în care este determinată activitatea enzimatică,

· temperatura trebuie să corespundă cu temperatura optimă a enzimei;

· pH-ul mediului trebuie să corespundă cu pH-ul optim al acestei enzime;

· concentratia substratului nu trebuie sa fie mai mica decat cea saturata;

· cofactorii trebuie să fie prezenți dacă această enzimă are;

Activatorii enzimatici trebuie să fie prezenți.

Astfel, activitatea enzimei este determinată în condiții optime. În aceste condiții, activitatea enzimei este proporțională cu conținutul ei din proba de testat și, prin urmare, poate fi utilizată pentru a estima indirect concentrația acesteia.

Activitatea enzimatică este exprimată cantitativ în unități de activitate. O unitate de activitate a enzimei (U) este activitatea enzimatică la care, sub influența sa, se formează 1 µmol de produs de reacție (sau 1 µmol de substrat dispare) pe minut.. În sistemul SI, unitatea de activitate enzimatică este katal (kat). 1 catal corespunde activității enzimatice în care se formează un mol de produs de reacție (un mol de substrat dispare) pe secundă.

Valoarea activității specifice este, de asemenea, utilizată pentru a caracteriza enzimele. Această unitate reflectă activitatea enzimei pe unitate de masă și este exprimată în µmol/min mg proteină. Unități de activitate specifice sunt utilizate pentru a evalua puritatea preparatelor enzimatice. Cu cât valoarea activității specifice este mai mare, cu atât preparatul enzimatic este mai pur.

Cinetica enzimatică studiază influența diverșilor factori (concentrații de S și E, pH, temperatură, presiune, inhibitori și activatori) asupra vitezei reacțiilor enzimatice. Scopul principal al studierii cineticii reacțiilor enzimatice este obținerea de informații care să permită o înțelegere mai profundă a mecanismului de acțiune al enzimelor.

Curba cinetică vă permite să determinați viteza de reacție inițială V 0 .

Curba de saturație a substratului.

Dependența vitezei de reacție de concentrația enzimei.

Dependența vitezei de reacție de temperatură.

Dependența vitezei de reacție de pH.

pH-ul optim pentru acțiunea majorității enzimelor se află în intervalul fiziologic de 6,0-8,0. Pepsina este activă la pH 1,5-2,0, ceea ce corespunde acidității sucului gastric. Arginaza, o enzimă specifică ficatului, este activă la 10,0. Influența pH-ului asupra vitezei unei reacții enzimatice este asociată cu starea și gradul de ionizare a grupărilor ionogene din moleculele de enzimă și substrat. Acest factor determină conformația proteinei, starea centrului activ și a substratului, formarea complexului enzimă-substrat și procesul de cataliză în sine.

Descrierea matematică a curbei de saturație a substratului, constanta Michaelis .

Ecuația care descrie curba de saturație a substratului a fost propusă de Michaelis și Menton și poartă numele lor (ecuația Michaelis-Menten): V = (V MAX *[ S])/(Km+[ S]) , unde Km este constanta Michaelis. Este ușor de calculat că atunci când V = V MAX /2 Km = [S], i.e. Km este concentrația de substrat la care viteza de reacție este ½ V MAX. Pentru a simplifica determinarea V MAX și Km, ecuația Michaelis-Menten poate fi recalculată. 1/V = (Km+[S])/(V MAX *[S]), 1/V = Km/(V MAX *[S]) + 1/V MAX ,

1/ V = Km/ V MAX *1/[ S] + 1/ V MAX Ecuația Lineweaver-Burk. Ecuația care descrie diagrama Lineweaver-Burk este ecuația unei linii drepte (y = mx + c), unde 1/V MAX este interceptarea dreptei pe axa y; Km/V MAX - tangenta unghiului de inclinare al dreptei; intersectia dreptei cu axa absciselor da valoarea 1/Km. Graficul Lineweaver-Burk vă permite să determinați Km dintr-un număr relativ mic de puncte. Acest grafic este folosit și la evaluarea efectului inhibitorilor, așa cum va fi discutat mai jos. Valoarea Km variază foarte mult: de la 10 -6 mol/l pentru enzimele foarte active, la 10 -2 pentru enzimele slab active.

Estimările Km au valoare practică. La concentrații de substrat de 100 de ori mai mari decât Km, enzima va funcționa la viteză aproape maximă, astfel încât viteza maximă V MAX va reflecta cantitatea de enzimă activă prezentă. Această circumstanță este utilizată pentru a estima conținutul de enzime din preparat. În plus, Km este o caracteristică a unei enzime care este utilizată pentru a diagnostica enzimopatiile.

Inhibarea activității enzimatice.

O caracteristică extrem de caracteristică și importantă a enzimelor este inactivarea lor sub influența anumitor inhibitori.

Inhibitori - sunt substante care determina inhibarea partiala sau completa a reactiilor catalizate de enzime.

Inhibarea activității enzimatice poate fi ireversibilă sau reversibilă, competitivă sau necompetitivă.

Inhibare ireversibilă - aceasta este inactivarea persistentă a enzimei, rezultată din legarea covalentă a unei molecule inhibitoare în situsul activ sau într-un alt centru special care modifică conformația enzimei. Este practic exclusă disocierea unor astfel de complexe stabile cu regenerarea enzimei libere. Pentru a depăși consecințele unei astfel de inhibiții, organismul trebuie să sintetizeze noi molecule de enzime.

Inhibarea reversibilă – caracterizată prin complexarea de echilibru a inhibitorului cu enzima datorită legăturilor necovalente, ca urmare a căreia astfel de complexe sunt capabile să se disocieze cu restabilirea activității enzimatice.

Clasificarea inhibitorilor în competitivi și necompetitivi se bazează pe dacă sunt slăbiți ( inhibiție competitivă ) sau nu slăbit ( inhibiție necompetitivă ) efectul lor inhibitor atunci când concentrația de substrat crește.

Inhibitori competitivi - acestea sunt, de regulă, compuși a căror structură este similară cu structura substratului. Acest lucru le permite să se lege în același loc activ ca și substraturile, împiedicând enzima să interacționeze cu substratul deja în stadiul de legare. După legare, inhibitorul poate fi transformat într-un produs sau poate rămâne în situsul activ până când apare disocierea.

Inhibarea competitivă reversibilă poate fi reprezentat sub formă de diagramă:

E↔ E-I → E + P 1

S (inactiv)

Gradul de inhibare a enzimei este determinat de raportul dintre concentrațiile de substrat și enzime.

Un exemplu clasic al acestui tip de inhibiție este inhibarea activității succinat dehidrogenazei (SDH) de către malat, care înlocuiește succinatul de la locul substratului și previne conversia acestuia în fumarat:

Legarea covalentă a inhibitorului la locul activ are ca rezultat inactivarea enzimei (inhibare ireversibilă). Exemplu inhibiție competitivă ireversibilă poate servi ca inactivare a triozofosfat izomerazei cu 3-cloroacetol fosfat. Acest inhibitor este un analog structural al substratului, dihidroxiacetona fosfat, și se leagă ireversibil la reziduul de acid glutamic din situsul activ:

Unii inhibitori acționează mai puțin selectiv, interacționând cu o grupă funcțională specifică din centrul activ al diferitelor enzime. Astfel, legarea iodoacetatului sau amidei sale de grupa SH a aminoacidului cisteină, situată în centrul activ al enzimei și participând la cataliză, duce la o pierdere completă a activității enzimatice:

R-SH + JCH2COOH → HJ + R-S-CH2COOH

Prin urmare, acești inhibitori inactivează toate enzimele care au grupări SH implicate în cataliză.

Inhibarea ireversibilă a hidrolazelor sub acțiunea gazelor nervoase (sarin, soman) se datorează legării lor covalente de reziduul de serină din centrul activ.

Metoda inhibiției competitive și-a găsit o largă aplicare în practica medicală. Medicamentele sulfonamide, antagonişti ai acidului p-aminobenzoic, pot servi ca exemplu de inhibitori competitivi metabolizaţi. Se leagă de dihidropterat sintetaza, o enzimă bacteriană care transformă p-aminobenzoatul în acid folic, necesar pentru creșterea bacteriilor. Bacteria moare ca urmare a faptului că sulfanilamida legată este transformată într-un alt compus și nu se formează acid folic.

Inhibitori necompetitivi de obicei se leagă de molecula de enzimă la un loc diferit de locul de legare a substratului, iar substratul nu concurează direct cu inhibitorul. Deoarece inhibitorul și substratul se leagă de centri diferiți, formarea atât a complexului E-I cât și a complexului S-E-I este posibilă. Complexul S-E-I se descompune, de asemenea, pentru a forma un produs, dar cu o rată mai lent decât E-S, astfel încât reacția va încetini, dar nu se va opri. Astfel, pot apărea următoarele reacții paralele:

E↔ E-I ↔ S-E-I → E-I + P

Inhibarea necompetitivă reversibilă este relativ rară.

Se numesc inhibitori necompetitivi alosterică spre deosebire de cele competitive ( izosterică ).

Inhibarea reversibilă poate fi studiată cantitativ folosind ecuația Michaelis-Menten.

Cu inhibiția competitivă, V MAX rămâne constant și Km crește.

Cu inhibiția necompetitivă, V MAX scade în timp ce Km rămâne neschimbat.

Dacă un produs de reacție inhibă enzima care catalizează formarea acesteia, se numește această metodă de inhibare retroinhibarea sau inhibarea feedback-ului . De exemplu, glucoza inhibă glucoza-6-fosfataza, care catalizează hidroliza glucozei-6-fosfatului.

Semnificația biologică a acestei inhibiții este reglarea anumitor căi metabolice (vezi lecția următoare).

PARTEA PRACTICĂ

Temă pentru studenți

1. Studiați denaturarea proteinelor sub influența soluțiilor de acizi minerali și organici și la încălzire.

2. Detectați coenzima NAD în drojdie.

3. Determinați activitatea amilazei în urină (serul de sânge).

9. STANDARDE PENTRU RĂSPUNSURI LA PROBLEME, întrebări de test utilizate pentru a controla cunoștințele în clasă (pot fi folosite ca anexă)

10. NATURA ŞI SCOPUL POSIBILELOR LUCRĂRI EDUCAŢIONALE ŞI DE CERCETARE PE TEMA

(Indicați în mod specific natura și forma UIRS: pregătirea prezentărilor rezumate, efectuarea de cercetări independente, jocuri de simulare, completarea unui istoric medical folosind literatura monografică și alte forme)

Cinetica enzimatică studiază viteza reacțiilor catalizate de enzime în funcție de diferite condiții (concentrație, temperatură, pH etc.) de interacțiune a acestora cu substratul.

Cu toate acestea, enzimele sunt proteine ​​care sunt sensibile la influența diferitelor influențe externe. Prin urmare, atunci când studiază viteza reacțiilor enzimatice, acestea iau în considerare în principal concentrațiile de substanțe care reacţionează și încearcă să minimizeze influența temperaturii, pH-ului mediului, activatorilor, inhibitorilor și alți factori și creează condiții standard. În primul rând, aceasta este valoarea pH-ului mediului care este optimă pentru o anumită enzimă. În al doilea rând, se recomandă menținerea unei temperaturi de 25°C, acolo unde este posibil. În al treilea rând, se obține saturația completă a enzimei cu substratul. Acest punct este deosebit de important deoarece la concentrații scăzute de substrat, nu toate moleculele de enzime participă la reacție (Fig. 6.5, A), ceea ce înseamnă că rezultatul va fi departe de maximul posibil. Cea mai mare putere a reacției catalizate, celelalte lucruri fiind egale, se realizează dacă fiecare moleculă de enzimă participă la transformare, adică. la concentrații mari ale complexului enzimă-substrat (Fig. 6.5, V). Dacă concentrația substratului nu asigură saturarea completă a enzimei (Fig. 6.5, b), atunci viteza reacției nu își atinge valoarea maximă.

Orez. 65.

A - la concentrație scăzută de substrat; 6 - cu concentrație insuficientă de substrat; V - când enzima este complet saturată cu substrat

Viteza unei reacții enzimatice măsurată în condițiile de mai sus și saturația completă a enzimei cu substratul se numește viteza maximă de reacție enzimatică (V).

Viteza unei reacții enzimatice, determinată atunci când enzima nu este complet saturată cu substratul, se notează v.

Cataliza enzimatică poate fi simplificată prin următoarea diagramă:

unde F este o enzimă; S - substrat; FS - complex enzima-substrat.

Fiecare etapă a acestui proces este caracterizată de o anumită viteză. Unitatea de măsură pentru viteza unei reacții enzimatice este numărul de moli de substrat transformați pe unitatea de timp(la fel ca viteza unei reacții normale).

Interacțiunea enzimei cu substratul duce la formarea unui complex enzimă-substrat, dar acest proces este reversibil. Viteza reacțiilor directe și inverse depind de concentrațiile reactanților și sunt descrise prin ecuațiile corespunzătoare:

În echilibru, ecuația (6.3) este valabilă, deoarece vitezele reacțiilor directe și inverse sunt egale.

Înlocuind valorile vitezei reacțiilor înainte (6.1) și inversă (6.2) în ecuația (6.3), obținem egalitatea:

Starea de echilibru se caracterizează printr-o corespunzătoare constanta de echilibru K p, egal cu raportul constantelor reacțiilor directe și inverse (6.5). Se numește reciproca constantei de echilibru constanta substratului Ks, sau constanta de disociere a complexului enzimă-substrat:

Din ecuația (6.6) este clar că constanta substratului scade la concentrații mari ale complexului enzimă-substrat, adică. cu mare stabilitate. În consecință, constanta substratului caracterizează afinitatea enzimei și substratului și raportul constantelor de viteză pentru formarea și disocierea complexului enzimă-substrat.

Fenomenul de saturație enzimatică cu substrat a fost studiat de Leonor Michaelis și Maud Mepten. Pe baza prelucrării matematice a rezultatelor, au derivat ecuația (6.7), care și-a primit numele, din care este clar că la o concentrație mare de substrat și o valoare scăzută a constantei substratului, viteza reacției enzimatice tinde spre maxim. . Cu toate acestea, această ecuație este limitată deoarece nu ia în considerare toți parametrii:

Complexul enzimă-substrat în timpul reacției poate suferi transformări în diferite direcții:

• se disociază în substanțele părinte;
• se transformă într-un produs din care enzima este separată neschimbată.

Prin urmare, pentru a descrie acțiunea generală a procesului enzimatic, conceptul constantele Michaelis Kt, care exprimă relația dintre constantele de viteză ale tuturor celor trei reacții ale catalizei enzimatice (6.8). Dacă ambii termeni sunt împărțiți la constanta vitezei de reacție pentru formarea complexului enzimă-substrat, obținem expresia (6.9):

Din ecuația (6.9) rezultă un corolar important: constanta Michaelis este întotdeauna mai mare decât constanta substratului cu cantitatea k 2 /k v

Numeric K t egală cu concentrația substratului la care viteza de reacție este jumătate din viteza maximă posibilă și corespunde saturației enzimei cu substratul, ca în fig. 6.5, b. Deoarece în practică nu este întotdeauna posibil să se obțină saturarea completă a enzimei cu substratul, este tocmai K t utilizat pentru caracterizarea comparativă a caracteristicilor cinetice ale enzimelor.

Viteza reacției enzimatice când enzima nu este complet saturată cu substratul (6.10) depinde de concentrația complexului enzimă-substrat. Coeficientul de proporționalitate este constanta de reacție pentru eliberarea enzimei și a produsului, deoarece aceasta modifică concentrația complexului enzimă-substrat:

După transformări, ținând cont de dependențele de mai sus, viteza reacției enzimatice atunci când enzima nu este complet saturată cu substratul este descrisă prin ecuația (6.11), i.e. depinde de concentrațiile enzimei, substratului și de afinitatea acestora K s:

Dependența grafică a vitezei unei reacții enzimatice de concentrația substratului nu este liniară. După cum este evident din fig. 6.6, odată cu creșterea concentrației de substrat, se observă o creștere a activității enzimatice. Cu toate acestea, când se atinge saturația maximă a enzimei cu substratul, viteza reacției enzimatice devine maximă. Prin urmare, factorul de limitare a vitezei pentru reacție este formarea unui complex enzimă-substrat.

Practica a arătat că concentrațiile de substrat, de regulă, sunt exprimate în valori mult mai mici decât unitate (10 6 -10 3 mol). Este destul de dificil să operați cu astfel de cantități în calcule. Prin urmare, G. Lineweaver și D. Burke au propus să exprime dependența grafică a vitezei unei reacții enzimatice nu în coordonate directe, ci în coordonate inverse. Ei au pornit de la presupunerea că, pentru cantități egale, inversele lor sunt de asemenea egale:

Orez. 6.6.

După transformarea expresiei (6.13), obținem o expresie numită Ecuația Lineweaver-Burk (6.14):

Dependența grafică a ecuației Lineweaver-Burk este liniară (Fig. 6.7). Caracteristicile cinetice ale enzimei sunt determinate după cum urmează:

• segmentul tăiat pe axa ordonatelor este egal cu 1/V;
• segmentul tăiat pe axa absciselor este egal cu -1 /La t.

Orez. 6.7.

Se crede că metoda Lineweaver-Burk face posibilă determinarea vitezei maxime de reacție mai precis decât în ​​coordonatele directe. Informații valoroase cu privire la inhibarea enzimelor pot fi, de asemenea, adunate din acest grafic.

Există și alte moduri de a transforma ecuația Michaelis-Menten. Dependențe grafice sunt folosite pentru a studia influența diferitelor influențe externe asupra procesului enzimatic.

Această ramură a enzimologiei studiază influența diverșilor factori asupra vitezei unei reacții enzimatice. Luând în considerare ecuația generală pentru cataliza enzimatică a reacției reversibile de conversie a unui substrat într-un singur produs (1),

Principalii factori care influențează viteza unei reacții enzimatice ar trebui numiți: concentrația substratului [S], concentrația enzimei [E] și concentrația produsului de reacție [P].

Interacțiunea unor enzime cu substratul lor poate fi descrisă printr-o curbă hiperbolică a dependenței vitezei de reacție enzimatică V de concentrația substratului [S] (Fig. 19):

Fig. 19. Dependenţa vitezei de reacţie enzimatică de concentraţia substratului.

Pe această curbă se pot distinge trei secțiuni, care pot fi explicate prin prevederile mecanismului de interacțiune a enzimei cu substratul: OA - o secțiune de dependență direct proporțională a lui V de [S], centrii activi ai enzimei. sunt umplute treptat cu molecule de substrat cu formarea unui complex ES instabil; secțiunea AB - dependența curbilinie a lui V de [S], saturația completă a centrilor activi ai enzimei cu molecule de substrat nu a fost încă atinsă. Complexul ES este instabil înainte de a ajunge la starea de tranziție, probabilitatea de disociere inversă la E și S este încă mare; secțiunea BC - dependența este descrisă printr-o ecuație de ordinul zero, secțiunea este paralelă cu axa [S], s-a realizat saturația completă a enzimelor active cu molecule de substrat, V=V max.

Forma caracteristică a curbei este descrisă matematic de ecuația Briggs-Haldane:

V=V max ● [S]/ Km + [S] (2),

unde Km este constanta Michaelis-Menten, numeric egală cu concentrația substratului la care viteza reacției enzimatice este egală cu jumătate de V max.

Cu cât este mai mic Km al enzimei, cu atât este mai mare afinitatea enzimei pentru substrat, cu atât mai rapid este atinsă starea de tranziție pentru substrat și se transformă într-un produs de reacție. Găsirea valorilor Km pentru fiecare substrat enzimatic specific grupului este importantă în determinarea rolului biologic al acestei enzime în celulă.

Pentru majoritatea enzimelor este imposibilă construirea unei curbe hiperbolice (Fig. 19). În acest caz, se utilizează metoda dublelor reciproce (Lineweaver-Burk), adică. este reprezentată grafic o dependență de 1/[V] față de 1/[S] (Fig. 20). Metoda de construire a unor astfel de curbe într-un experiment este foarte convenabilă atunci când se studiază efectul diferitelor tipuri de inhibitori asupra activității enzimelor (a se vedea mai departe în text).

Fig.20. Graficul 1/[V] versus 1/[S] (metoda Lineweaver-Burk),

unde y este secțiunea de tăiere - și x este secțiunea de tăiere - , tangenta unghiului α - .

Dependența vitezei reacției enzimatice V de concentrația enzimei [E].

Această dependență grafică (Fig. 21) este considerată la temperatura și pH-ul optim al mediului, la concentrații de substrat semnificativ mai mari decât concentrația de saturație a centrilor activi ai enzimei.

Orez. 21. Influența concentrației enzimatice asupra vitezei de reacție enzimatică.

Dependența vitezei unei reacții enzimatice de concentrația unui cofactor sau coenzimă. Pentru enzimele complexe, trebuie luat în considerare faptul că o deficiență a formelor coenzimatice de vitamine în caz de hipovitaminoză și o încălcare a aportului de ioni metalici în organism duc în mod necesar la o scădere a concentrației enzimelor corespunzătoare necesare cursului. a proceselor metabolice. Prin urmare, trebuie concluzionat că activitatea enzimei este direct dependentă de concentrația cofactorului sau coenzimei.

Influența concentrației produsului asupra vitezei de reacție enzimatică. Pentru reacțiile reversibile care apar în corpul uman, trebuie luat în considerare faptul că produsele reacției directe pot fi utilizate de enzimă ca substraturi pentru reacția inversă. Prin urmare, direcția curgerii și momentul atingerii Vmax depind de raportul dintre concentrațiile substraturilor inițiale și ale produselor de reacție. De exemplu, activitatea alanin aminotransferazei, care catalizează transformarea:

Alanină + Alfa-cetoglutarat ↔ Piruvat + Glutamat

depinde în celulă de raportul de concentrație:

[alanina + alfa-cetoglutarat] / [piruvat + glutamat].

MECANISMUL DE ACȚIUNE A ENZIMELOR. TEORII ALE CATALIZEI ENZIMICE

Enzimele, precum catalizatorii non-proteici, cresc viteza unei reacții chimice datorită capacității lor de a reduce energia de activare a acestei reacții. Energia de activare a unei reacții enzimatice este calculată ca diferența dintre valoarea energiei din sistem a reacției în curs care a atins starea de tranziție și energia determinată la începutul reacției (vezi dependența grafică din Fig. 22).

Orez. 22. Dependența grafică a stării energetice a unei reacții chimice fără o enzimă (1) și în prezența unei enzime (2) de timpul de reacție.

Lucrările lui V. Henry și, în special, a lui L. Michaelis, M. Menten privind studierea mecanismului reacțiilor enzimatice reversibile monosubstrate au făcut posibilă postularea că enzima E se combină mai întâi reversibil și relativ rapid cu substratul său S pentru a forma o enzimă- complex de substrat (ES):

E+S<=>ES (1)

Formarea ES are loc datorită legăturilor de hidrogen, interacțiunilor electrostatice, hidrofobe, în unele cazuri covalente, legăturilor de coordonare între radicalii laterali ai resturilor de aminoacizi ai centrului activ și grupările funcționale ale substratului. În enzimele complexe, funcția de contact cu substratul poate fi îndeplinită și de partea neproteică a structurii.

Complexul enzimă-substrat se dezintegrează apoi într-o a doua reacție, mai lentă, reversibilă pentru a produce produsul de reacție P și enzima liberă E:

ES<=>EP<=>E+P (2)

În prezent, datorită muncii oamenilor de știință menționați mai sus, precum și a Keilin D., Chance B., Koshland D. (teoria „corespondenței induse”), există prevederi teoretice despre patru puncte principale în mecanismul de acțiune a unei enzime pe un substrat, care determină capacitatea enzimelor de a accelera reacțiile chimice:

1. Orientare și abordare . Enzima este capabilă să lege o moleculă de substrat în așa fel încât legătura atacată de enzimă să fie situată nu numai în imediata apropiere a grupării catalitice, ci și orientată corect față de aceasta. Probabilitatea ca complexul ES să ajungă la starea de tranziție prin orientare și proximitate este mult crescută.

2. Stresul și încordarea : corespondență indusă. Atașarea unui substrat poate provoca modificări conformaționale ale moleculei de enzimă, care conduc la tensiune în structura centrului activ și, de asemenea, deformează oarecum substratul legat, facilitând astfel atingerea unei stări de tranziție de către complexul ES. O așa-numită corespondență indusă apare între moleculele E și S.

Viteza reacțiilor enzimatice depinde de concentrația enzimei, substrat, temperatură, pH și prezența activatorilor și inhibitorilor.

În condiții de exces de substrat, viteza de reacție direct proportional concentrația de enzime (Fig. 3.2).

Orez. 3.2. Dependența vitezei de reacție de concentrația enzimei.

Dependența vitezei de reacție de concentrația substratului prezentate în Figura 3.3.

Orez. 3.3. Dependența vitezei de reacție de concentrația substratului.

Există 3 secțiuni pe grafic. La concentrație scăzută de substrat (secțiunea A) viteza de reacție este direct proporțională cu concentrația substratului și respectă cinetica de ordinul întâi. Locația activată b(reacție de ordin mixt) această dependență este încălcată. Locația activată c viteza de reacție este maximă și nu depinde de concentrația substratului.

O reacție enzimatică este caracterizată prin formarea unui complex enzimă-substrat, care se descompune pentru a forma enzima liberă și produsul de reacție.

În această ecuație, k 1 este constanta de viteză pentru formarea complexului enzimă-substrat, k 2 este constanta de disociere a complexului enzimă-substrat pentru a forma o enzimă liberă și un substrat și k 3 este constanta de viteză pentru disociere a complexului enzimă-substrat la enzima liberă și produsul de reacție.

Michaelis și Menten au propus o ecuație care descrie dependența vitezei de reacție de concentrația substratului.

v este viteza de reacție la o concentrație dată de substrat; Ks – constanta de disociere a complexului enzima-substrat; Vmax – viteza maximă de reacție.

Ks=k -2 /k 1 adică. raportul dintre constanta de reacție inversă și constanta de reacție directă.

Cu toate acestea, această ecuație descrie numai secțiunea A pe grafic și nu ia în considerare influența produșilor de reacție asupra vitezei procesului enzimatic.

Haldane și Briggs au înlocuit constanta de disociere din ecuație cu constanta Michaelis (Km).

Michaelis constantă numeric egală cu concentrația substratului, la care viteza de reacție este jumătate din maxim. Constanta Michaelis caracterizează afinitatea enzimei și a substratului. O afinitate mare a unei enzime pentru un substrat se caracterizează printr-o valoare Km scăzută și invers.

Utilizarea graficului propus de Michaelis și Menten este incomod. Pentru o reprezentare grafică mai convenabilă, G. Lineweaver și D. Burke au transformat ecuația Haldane și Briggs folosind metoda dublelor reciproce, pe baza principiului că dacă există egalitate între două mărimi, atunci și reciprocele vor fi egale.

Reprezentarea grafică a dependenței vitezei de reacție de pH are forma de clopot. Se numește valoarea pH-ului la care enzima prezintă activitate maximă pH-ul optim(Fig. 5.4 A) . Pentru majoritatea enzimelor, pH-ul optim este 6-8. Excepție este pepsina, al cărei optim este 2,0. Când pH-ul se modifică într-o direcție sau alta de la optim, viteza de reacție scade din cauza ionizării grupărilor funcționale ale enzimei și substratului, ceea ce perturbă formarea complexului enzimă-substrat.

Orez. 3.4. Dependența vitezei de reacție de pH (A) și temperatură (B).

Viteza unei reacții chimice crește de 2 ori odată cu creșterea temperatura cu 10°C. Cu toate acestea, datorită naturii proteice a enzimei, cu o creștere suplimentară a temperaturii, are loc denaturarea enzimei. Se numește temperatura la care viteza de reacție este maximă temperatura optima(Fig. 3.4. B) . Pentru majoritatea enzimelor, temperatura optimă este de 37-40°C. Excepție este miokinaza musculară, care poate rezista la încălzire până la 100°C.

Activatori enzimatici– acestea sunt substanțe 1) care formează centrul activ al enzimei (Co 2+, Mg 2+, Zn 2+, Fe 2+, Ca 2+); 2) facilitarea formării complexului enzimă-substrat (Mg 2+); 3) grupări reducătoare SH (glutation, cisteină, mercaptoetanol); 4) stabilizarea structurii native a proteinei-enzime. Reacțiile enzimatice sunt de obicei activate de cationi (în tabelul periodic de la 19 la 30). Anionii sunt mai puțin activi, deși ionii de clor și anionii altor halogeni pot activa pepsina, amilaza și adenilat ciclaza. Proteinele pot fi activatori: apoproteina A-I (LCAT), apoproteina C-II (LPL).

Mecanismul de acțiune al activatorilor:

1) participă la formarea centrului activ al enzimelor;

2) facilitează legarea substratului și a enzimei;

3) participă la formarea structurii native a enzimei.

Inhibitori– substanțe care provoacă inhibarea parțială sau completă a reacțiilor catalizate de enzime.

Inhibitorii sunt clasificați în nespecificeȘi specific. Acțiunea inhibitorilor nespecifici nu este legată de mecanismul de acțiune al enzimelor. Acești inhibitori determină denaturarea proteinei enzimatice (căldură, acizi, alcalii, săruri ale metalelor grele etc.).

Inhibitorii specifici afectează mecanismul de acțiune al enzimelor. Inhibitorii specifici sunt împărțiți în 2 grupe: reversibile și ireversibile. Inhibitorii ireversibili provoacă o schimbare sau modificare permanentă, ireversibilă a grupărilor funcționale ale enzimei prin legare strânsă sau covalentă. Acest grup include: 1) inhibitori ai metalelor enzime (HCN, RCN, HF, CO etc.). Acești compuși se leagă de metale cu valență variabilă (Cu sau Fe), drept urmare procesul de transfer de electroni de-a lungul lanțului respirator al enzimelor este întrerupt. Prin urmare, acești inhibitori sunt numiți otrăvuri respiratorii. 2) inhibitori ai enzimelor care conțin grupări SH(monoidoacetat, diiodoacetat, iodoacetamidă, compuși de arsen și mercur). 3) inhibitori ai enzimelor care conțin o grupă OH în centrul activ (compuși organofosforici, insecticide). Acești inhibitori inhibă, în primul rând, activitatea colinesterazei, enzimă care joacă un rol primordial în activitatea sistemului nervos.

Reversibil inhibiția poate fi cuantificată folosind ecuația Michaelis-Menten. Inhibitorii reversibile se împart în competitiv și necompetitiv.

Inhibitori competitivi- Acestea sunt substanțe asemănătoare ca structură cu substratul. Inhibitorul se leagă de locul activ al enzimei și previne formarea complexului enzimă-substrat.

Un exemplu clasic de inhibiție competitivă este inhibarea succinat dehidrogenazei de către acidul malonic. Succinat dehidrogenaza catalizează oxidarea acidului succinic (succinat) prin dehidrogenare la acid fumaric.

Dacă în mediu se adaugă acid malonic (un inhibitor), atunci, ca urmare a asemănării sale structurale cu succinatul adevărat al substratului, acesta va reacționa cu locul activ pentru a forma un complex enzimă-inhibitor, dar reacția nu va avea loc.

Efectul inhibitorului este eliminat prin creşterea concentraţiei substratului. Cu inhibiția competitivă, cinetica reacțiilor enzimatice se modifică: Km crește, V max rămâne constantă(Fig. 3.5).

Orez. 3.5. Efectul inhibitorilor competitivi asupra vitezei de reacție enzimatică

Metoda inhibiției competitive și-a găsit aplicație în practica medicală ca antimetaboliti.

De exemplu, medicamentele sulfonamide sunt folosite pentru a trata unele boli infecțioase cauzate de bacterii. Aceste medicamente sunt similare structural cu acidul para-aminobenzoic, pe care celula bacteriană îl folosește pentru a sintetiza acidul folic, care este necesar pentru viața bacteriilor. Datorită acestei asemănări structurale, sulfonamida blochează acțiunea enzimei prin deplasarea acidului para-aminobenzoic din complexul cu enzima care sintetizează acidul folic.

Inhibitori necompetitivi - substanțe care nu sunt similare structural cu substraturile. Inhibitorii necompetitivi se leagă nu la locul activ, ci la o altă locație din molecula de enzimă, de exemplu, în centrul alosteric. Aceasta modifică conformația centrului activ în așa fel încât interacțiunea substratului cu acesta este perturbată.

Pentru inhibiția necompetitivă: V max scade, dar K m nu se modifică(Fig. 3.6).