Determinarea numărului de celule însămânțate pe mediu nutritiv dens (metoda plăcii lui Koch). Lucrările lui R. Koch și semnificația lor pentru microbiologie și patologia infecțioasă Izolarea unei culturi pure de aerobi Microbiologie

Principalele etape în dezvoltarea microbiologiei, virologiei și imunologiei

Acestea includ următoarele:

1.cunoștințe empirice(înainte de inventarea microscoapelor și utilizarea lor pentru a studia microlumea).

J. Fracastoro (1546) a sugerat natura vie a agenților bolilor infecțioase – contagium vivum.

2.Perioada morfologică a durat vreo două sute de ani.

Anthony van Leeuwenhoek în 1675 a descris pentru prima dată protozoarele, în 1683 - principalele forme de bacterii. Imperfecțiunea instrumentelor (măsirea maximă a microscoapelor X300) și a metodelor de studiere a microlumii nu au contribuit la acumularea rapidă a cunoștințelor științifice despre microorganisme.

3.Perioada fiziologică(din 1875) - epoca lui L. Pasteur și R. Koch.

L. Pasteur - studiul fundamentelor microbiologice ale proceselor de fermentație și degradare, dezvoltarea microbiologiei industriale, elucidarea rolului microorganismelor în circulația substanțelor în natură, descoperirea anaerob microorganisme, dezvoltarea principiilor asepsie, metode sterilizare, atenuare ( atenuare)virulenţă si primind vaccinuri (tulpini de vaccin).

R. Koch – metoda de selecție culturi pure pe medii nutritive solide, metode de colorare a bacteriilor cu coloranți anilină, descoperirea antraxului, holerei ( virgula lui Koch), tuberculoză (Bețe Koch),îmbunătățirea tehnicilor de microscopie. Fundamentarea experimentală a criteriilor Henle, cunoscute sub numele de postulate (triada) lui Henle-Koch.

4.perioada imunologică.

I.I. Mechnikov este un „poet al microbiologiei” conform definiției figurative a lui Emil Roux. El a creat o nouă eră în microbiologie - doctrina imunității (imunitate), după ce a dezvoltat teoria fagocitozei și a fundamentat teoria imunității celulare.

În același timp, s-au acumulat date privind producția în organism anticorpiîmpotriva bacteriilor și a acestora toxine ceea ce i-a permis lui P. Erlich să dezvolte teoria umorală a imunității. În discuția ulterioară, pe termen lung și fructuoasă, între susținătorii teoriilor fagocitare și umorale, au fost dezvăluite multe mecanisme ale imunității și s-a născut știința. imunologie.

Ulterior s-a constatat că imunitatea ereditară și dobândită depinde de activitatea coordonată a cinci sisteme principale: macrofage, complement, limfocite T și B, interferoni, principalul sistem de histocompatibilitate, oferind diferite forme de răspuns imun. I.I. Mechnikov și P. Erlich în 1908. a fost distins cu Premiul Nobel.

12 februarie 1892 la o reuniune a Academiei Ruse de Științe, D.I. Ivanovsky a raportat că agentul cauzal al bolii mozaic de tutun este un virus filtrabil. Această dată poate fi considerată o zi de naștere virologieși D.I. Ivanovsky - fondatorul acesteia. Ulterior, s-a dovedit că virușii provoacă boli nu numai la plante, ci și la oameni, animale și chiar bacterii. Cu toate acestea, numai după stabilirea naturii genei și a codului genetic, virușii au fost clasificați ca animale sălbatice.

5. Următorul pas important în dezvoltarea microbiologiei a fost descoperirea antibioticelor. În 1929 A. Fleming a descoperit penicilina și a început epoca terapiei cu antibiotice, care a dus la progresul revoluționar al medicinei. Mai târziu s-a dovedit că microbii se adaptează la antibiotice, iar studiul mecanismelor de rezistență la medicamente a condus la descoperirea unui al doilea genomului extracromozomial (plasmidic). bacterii.

Studiu plasmidă au arătat că sunt organisme chiar mai simple decât virușii și spre deosebire de acestea bacteriofagi nu dăunează bacteriilor, ci le înzestrează cu proprietăți biologice suplimentare. Descoperirea plasmidelor a completat semnificativ ideile despre formele de existență a vieții și posibilele moduri de evoluție a acesteia.

6. Modern stadiul genetic molecular dezvoltarea microbiologiei, virologiei și imunologiei a început în a doua jumătate a secolului al XX-lea în legătură cu realizările geneticii și biologiei moleculare, crearea microscopului electronic.

În experimente pe bacterii a fost dovedit rolul ADN-ului în transmiterea trăsăturilor ereditare. Utilizarea bacteriilor, virușilor și plasmidelor ulterioare ca obiecte de cercetare biologică moleculară și genetică a condus la o înțelegere mai profundă a proceselor fundamentale care stau la baza vieții. Elucidarea principiilor de codificare a informațiilor genetice în ADN-ul bacteriilor și stabilirea universalității codului genetic au făcut posibilă înțelegerea mai bună a tiparelor genetice moleculare inerente organismelor mai înalt organizate.

Descifrarea genomului Escherichia coli a făcut posibilă construirea și transplantul de gene. Pana acum Inginerie genetică a creat noi direcții biotehnologie.

Au fost descifrate organizarea genetică moleculară a multor virusuri și mecanismele interacțiunii acestora cu celulele, au fost stabilite capacitatea ADN-ului viral de a se integra în genomul unei celule sensibile și principalele mecanisme de carcinogeneză virală.

Imunologia a suferit o adevărată revoluție, depășind cu mult imunologia infecțioasă și devenind una dintre cele mai importante discipline medicale și biologice fundamentale. Până în prezent, imunologia este o știință care studiază nu numai protecția împotriva infecțiilor. În sensul modern Imunologia este o știință care studiază mecanismele de autoapărare a organismului de tot ce este străin genetic, menținând integritatea structurală și funcțională a organismului.

Imunologia cuprinde în prezent o serie de domenii de specialitate, printre care, alături de imunologia infecțioasă, cele mai semnificative includ imunogenetica, imunomorfologia, imunologia transplantului, imunopatologia, imunohematologia, oncoimunologia, imunologia ontogenezei, vaccinologia și imunodiagnosticul aplicat.

Microbiologie și virologie ca științe biologice fundamentale includ, de asemenea, o serie de discipline științifice independente cu propriile scopuri și obiective: generale, tehnice (industriale), agricole, veterinare și cele mai importante pentru umanitate microbiologie medicală și virologie.

Microbiologia medicală și virologia studiază agenții patogeni ai bolilor infecțioase umane (morfologia, fiziologia, ecologia acestora, caracteristicile biologice și genetice), elaborează metode de cultivare și identificare a acestora, metode specifice de diagnostic, tratament și prevenire a acestora.

Metoda Koch este utilizată pentru a determina numărul total de bacterii. Într-o cutie Petri sterilă goală, se toarnă 1 ml din materialul de testat din diluția corespunzătoare și se toarnă 10 - 15 ml de topit și se răcește la 45 0 C MPA, se amestecă cu lichidul, rotind cupa pe suprafața mesei.

Dupa cultivarea culturilor se numara coloniile crescute la suprafata si in profunzimea agarului. Pentru a face acest lucru, cana este așezată cu susul în jos pe un fundal negru, fiecare colonie numărată este marcată cu un marker pe pahar. Evaluați numai acele feluri de mâncare, care au crescut de la 30 la 300 de colonii. Dacă pe vas au crescut peste 300 de colonii și analiza nu poate fi repetată, atunci coloniile pot fi numărate sub iluminare laterală puternică folosind o lupă și o placă specială cu o grilă.

Numărul de colonii se numără în cel puțin 20 de pătrate de 1 cm 2 în diferite locuri ale vasului. Se calculează numărul mediu de colonii în 1 cm 2, care este înmulțit cu aria vasului.

La numărarea coloniilor, se poate folosi un dispozitiv special de numărare a bacteriilor, PSB.

Rezultatul numărării coloniilor din fiecare vas este numărul de bacterii la 1 ml (cm 3) sau 1 g de material de testat, ținând cont de diluție. Pentru numărul final de bacterii se ia media aritmetică a rezultatelor numărării coloniilor pe plăci cu inocularea a două diluții adiacente.

Exemplu: reproducere 10 -1 - 250 colonii, reproducere 10 -2 - 23 colonii.

Numărul total de bacterii = 250 x 10 + 23 x 100 / 2 = 2400 ufc / ml = 2,4 x 10 2 ufc / ml (unități formatoare de colonii la 1 ml).

Rezultatul cercetării poate fi rotunjit până la 2 - 3 cifre semnificative.

Metoda de titrare.

Folosit pentru a determina numărul de PSD-uri.

etapa 1: omogenizarea materialului. Dacă este necesar, prepararea unei suspensii pentru a transfera microorganismele într-o fază lichidă.

a 2-a etapa: prepararea unei serii de diluţii.

a 3-a etapa: inocularea unor volume selectate de material de testat (100, 10, 1 ml) și diluțiile sale de 1 ml într-un mediu nutritiv lichid. Pentru a îmbunătăți acuratețea metodei, fiecare volum poate fi semănat în paralel în mai multe porțiuni de mediu nutritiv (semănat cu două, trei, cinci rânduri). Optimal este o repetare triplă (fiabilitate suficientă la un cost relativ scăzut).

Etapa a 4-a: luând în considerare prezența creșterii pe un mediu nutritiv lichid și însămânțarea din volume pozitive pe un mediu nutritiv solid.

etapa a 5-a: identificarea microorganismelor crescute pe mediu nutritiv solid. În același timp, se iau în considerare proprietățile culturale și, dacă este necesar, se efectuează studii suplimentare (studiul proprietăților tinctoriale, morfologice, biochimice și serologice).

Dacă se utilizează o metodă pe un singur rând, rezultatul este de obicei exprimat ca titrul microorganismului țintă, care este considerat cel mai mic volum (cel mai mare diluție) în care a fost încă găsit.

Dacă s-a folosit o metodă cu mai multe rânduri, rezultatele sunt înregistrate folosind tabele speciale care permit, pe baza combinației de volume pozitive care au dat naștere, să se determine titrul, indicele (MP).

Medii speciale.

În bacteriologie, mediile nutritive uscate de producție industrială sunt utilizate pe scară largă, care sunt pulberi higroscopice care conțin toate componentele mediului, cu excepția apei. Pentru prepararea lor se folosesc digerări triptice de produse nealimentare ieftine (deșeuri de pește, făină de carne și oase, cazeină tehnică). Sunt convenabile pentru transport, pot fi depozitate pentru o lungă perioadă de timp, scutesc laboratoarele de procesul enorm de pregătire a mediilor și aduc problema standardizării mediilor mai aproape de rezolvare. Industria medicală produce medii uscate de Endo, Levin, Ploskirev, agar sulfit de bismut, agar nutritiv, carbohidrați cu indicator BP și altele.

termostate

Termostatele sunt folosite pentru cultivarea microorganismelor.

Un termostat este un dispozitiv care menține o temperatură constantă. Aparatul este format dintr-un incalzitor, o camera, pereti dubli intre care circula aer sau apa. Temperatura este controlată de un termostat. Temperatura optimă pentru reproducerea majorității microorganismelor este de 37°C.

ACTIVITATEA 7

TEMA: METODE DE IZOLARE A CULTURII AEROBICE PURE. ETAPE DE IZOLARE A CULTURII PURE A BACTERIILOR AEROBICE PRIN METODA DECUPLĂRII MECANICE

Planul lecției

1. Conceptul de „cultură pură” a bacteriilor

2. Metode de izolare a culturilor pure prin separare mecanică

3. Metode biologice de izolare a culturilor pure

4. Metode de identificare a bacteriilor

Scopul lecției: Pentru a familiariza elevii cu diferite metode de izolare a culturilor pure, pentru a învăța cum să facă culturi cu o buclă, lovituri, înțepătură

Orientări pentru demonstrație

În habitatul lor natural, bacteriile se găsesc în asociații. Pentru a determina proprietățile microbilor, rolul lor în desfășurarea procesului patologic, este necesar să existe bacterii sub formă de populații omogene (culturi pure). O cultură pură este o colecție de indivizi bacterieni din aceeași specie cultivați pe un mediu nutritiv.

Metode de izolare a culturilor pure de bacterii aerobe

Metoda Pasteur Metoda Koch Biologic Fizic

(are istoric (cablare de placă)

Sens)

Metoda chimică

Şciukevici

Modern

Semănat cu buclă Semănat cu spatulă

(metoda Drigalski)

Metode de izolare a culturilor pure:

1. Metodele de separare mecanică se bazează pe separarea microbilor prin frecarea succesivă a materialului de testat pe suprafața agarului.

a) Metoda lui Pasteur - este de importanță istorică, prevede diluarea secvențială a materialului de testat într-un mediu nutritiv lichid prin metoda laminare

b) Metoda Koch - metoda de aranjare a plăcilor - se bazează pe diluarea secvenţială a materialului de testat cu agar peptonă-carne, urmată de turnarea eprubetelor cu material diluat în vase Petri.

c) Metoda lui Drygalski - la semănat material abundent însămânțat cu microfloră, se folosesc 2-3 căni pentru semănat succesiv cu o spatulă.

d) Semănat cu buclă în mișcări paralele.

2. Metodele biologice se bazează pe proprietățile biologice ale agenților patogeni.

a) Biologic - infecție a animalelor foarte sensibile, unde microbii se înmulțesc și se acumulează rapid. În unele cazuri, această metodă este singura care vă permite să izolați cultura agentului patogen de la o persoană bolnavă (de exemplu, cu tularemie), în alte cazuri este mai sensibilă (de exemplu, izolarea pneumococului la șoarecii albi). sau agentul cauzal al tuberculozei la cobai).

b) Chimic - bazat pe rezistența la acid a micobacteriilor. Pentru a elibera materialul de flora însoțitoare, acesta
tratat cu o soluție acidă. Doar bacilii tuberculoși vor crește, deoarece microbii toleranți la acid sunt uciși de acid.

c) Metoda fizică se bazează pe rezistența sporilor la căldură. Pentru a izola culturile de bacterii formatoare de spori din
amestecuri, materialul se încălzește la 80°C și se inoculează pe un mediu nutritiv. Doar bacteriile cu spori vor crește, deoarece sporii lor au rămas în viață și au dat creștere.

d) Metoda lui Shukevich - bazată pe mobilitatea ridicată a proteusului vulgar, capabil să crească târâtor.

Metoda de preparare a plăcii de agar

MPA este topit într-o baie de apă, apoi răcit la 50-55°C. Gâtul flaconului este ars în flacăra unei lămpi cu alcool, vasele Petri se deschid astfel încât gâtul flacoanelor să intre, fără a atinge marginile vasului, se toarnă 10-15 ml de MPA, se închide capacul, scuturați vasul astfel încât mediul să fie distribuit uniform, lăsați-l pe o suprafață orizontală până se solidifică. După uscare, plăcile cu agar pe placă se păstrează la rece.

Semănat în buclă

Se ia o picătură de material cu o buclă răcită steril, o margine a cupei este ușor deschisă cu mâna stângă, se introduce o buclă în interior și se fac câteva mișcări la marginea opusă într-un singur loc, apoi bucla este ruptă. iar materialul se inoculează cu curse paralele de la o margine la alta a cupei cu un interval de 5-6 mm. La începutul semănării, când vor fi mulți microbi pe buclă, vor da o creștere confluentă, dar cu fiecare lovitură a microbilor pe buclă, vor fi din ce în ce mai puțini microbi și vor rămâne solitari și vor da colonii izolate.

Semănat după metoda Drygalski

Această metodă este utilizată la însămânțarea materialului abundent însămânțat cu microfloră (puroi, fecale, spută). Pentru semănat conform metodei Drygalsky, se iau o spatulă și mai multe căni (3-4). O spatulă este o unealtă realizată din sârmă de metal sau din sticlă, îndoită sub formă de triunghi sau în formă de L. Materialul este introdus în prima cană cu o buclă sau pipetă și distribuit uniform cu o spatulă pe suprafața mediului, cu aceeași spatulă, fără a-l arde, materialul este frecat în mediul nutritiv din a doua ceașcă, apoi în a treia. Cu această inoculare, prima placă va avea o creștere confluentă, iar coloniile izolate vor crește în plăcile ulterioare.

Sunt cunoscute relativ puține metode pentru izolarea bacteriilor ca culturi pure. Acest lucru se realizează cel mai frecvent prin izolarea celulelor individuale pe medii de creștere solide folosind metoda de inoculare cu striuri sau prin turnarea unei cantități mici de cultură lichidă în plăci ( metoda de diluare). Cu toate acestea, obținerea unei colonii separate nu garantează întotdeauna puritatea culturii, deoarece coloniile pot crește nu numai din celule individuale, ci și din grupurile lor. Dacă microorganismele formează mucus, atunci forme străine se atașează adesea de el. Pentru curățare, este de preferat să folosiți un mediu neselectiv (MPA) deoarece contaminanții cresc mai bine pe acesta și sunt mai ușor de detectat.

Obținerea coloniilor izolate pe un mediu nutritiv solid se realizează fie prin cernerea unei suspensii de microorganisme cu o spatulă ( metoda Koch), sau cu ajutorul unei bucle bacteriologice ( metoda accidentului vascular cerebral debilitant). Ca urmare a separării mecanice a celulelor microbiene, fiecare dintre ele poate da naștere unei colonii izolate dintr-o specie microbiană.

Cernerea cu spatula (metoda Koch) produs în următoarea secvență:

1) o picătură din cultura de îmbogățire se aplică pe suprafața mediului nutritiv din cana nr. 1 cu o pipetă sterilă și se distribuie cu o spatulă sterilă;

2) se scoate spatula, se inchide rapid cupa si se transfera spatula in cana nr. 2 fara a o steriliza. Simulați distribuția culturii pe întreaga suprafață a mediului atingând suprafața acestuia cu aceeași parte a spatulei care a fost folosită anterior pentru distribuirea probei;

3) exact aceleași acțiuni se efectuează în cana nr. 3, după care spatula este sterilizată;

4) cupele însămânțate sunt plasate într-un termostat și incubate la temperatura optimă.

După un anumit timp, cupele sunt scoase din termostat și se studiază creșterea microorganismelor. De obicei, în vasul nr. 1 se observă o creștere continuă a bacteriilor, coloniile sunt notate în vasele ulterioare.

Cernerea în buclă (metoda cursei de epuizare) implică inocularea unei anse bacteriologice dintr-o cultură de îmbogățire pe suprafața unui mediu de agar în cutii Petri. În prima etapă, se aplică o buclă cu cultura cu o serie de mișcări paralele pe mediul de agar (Figura 4.2, A). Ansa se sterilizează, se răcește pe partea neinoculată a mediului de agar și se trasează o serie de lovituri în direcția perpendiculară pe prima (Figura 4.2, B). Apoi bucla este sterilizată din nou, răcită și se aplică lovituri în direcție ÎN(Figura 4.2), iar după următoarea sterilizare - în direcția G(Figura 4.2). Cupele se pun intr-un termostat si dupa un anumit timp se iau in calcul rezultatele. De obicei pe lovituri AȘi B un număr mare de colonii cresc (uneori creștere continuă), în timp ce pe stroke ÎNȘi G se formează colonii izolate.

Figura 4.2 - Schema de cernere a bacteriilor cu lovituri pentru a obține colonii izolate

Diluții în serie în medii solide- cea mai simplă metodă de inoculare în plăci, care constă în faptul că după inocularea probei într-o eprubetă cu agar steril topit și răcit, mediul se amestecă, se toarnă într-o cutie Petri și se lasă să se solidifice. Pentru a obține colonii bine izolate, se prepară o serie de diluții succesive de zece ori și se adaugă imediat 1 ml de probe în vas, se adaugă 15-20 ml de mediu de agar topit și se amestecă prin agitarea vasului. Uneori, coloniile individuale sunt scufundate în agar și pot fi îndepărtate numai mecanic. De asemenea, este rău că bacteriile sunt în mediu la temperatura agarului topit de ceva timp.

Dacă, pe baza anumitor simptome ale plantelor și a rezultatelor examinării microscopice, se suspectează că agentul cauzal al bolii este o bacterie, următorul pas ar trebui să fie izolarea acesteia.

În acest caz, se presupune că agentul patogen este contaminat cu organisme asociate, adică există o populație mixtă. Pentru a obține agentul patogen ca o colonie de creștere separată, maceratul de țesut trebuie să fie striat pe mediu.

Semănat cu accident vascular cerebral. Cu o ansă de inoculare calcinată se ia o cantitate mică de macerat de țesut vegetal care conține bacterii și cu mișcări ușoare, fără a deteriora suprafața agarului, se aplică pe mediul nutritiv preparat cu 4-6 mișcări. După reaprinderea buclei, cupa cu mediu este întoarsă cu 90 ° la dreapta și apoi se aplică încă 4-6 mișcări de la a doua lovitură, acul este reaprins și se efectuează a treia inoculare. Se realizează astfel o astfel de diluare a materiei prime, în care bacteriile, după incubarea într-un termostat timp de 48-72 de ore la 28 ° C, formează colonii separate de diferite forme și culori. Coloniile sunt apoi transferate pentru studii suplimentare în tuburi de agar înclinat. O colonie este luată cu o buclă calcinată și, cu o mișcare atentă sub formă de șarpe sau în zig-zag, se aplică pe agar nutritiv.

Metoda de turnare Koch. Metoda de turnare Koch asigură că fiecare colonie este formată dintr-o singură celulă bacteriană. Cel mai bine este să suspendați materia primă în apă sterilă și să aplicați metoda Koch numai cu această diluție. O cantitate mică din suspensie este transferată în prima eprubetă cu un mediu nutritiv răcit la 60 °C. Apoi conținutul tubului este amestecat cu inoculul prin rotirea acestuia între palme. Apoi, luați a doua eprubetă, deschideți-o cu atenție peste flacăra arzătorului și transferați trei părți din substrat în ea din prima eprubetă cu bucle mari. Conținutul eprubetei după arderea gâtului și a dopului se toarnă în primul vas Petri, deschizând ușor capacul cupei doar cât să introducă gâtul eprubetei sub ea. Imediat după turnare, cana este închisă și mediul nutritiv este distribuit uniform cu mișcări atente.

După ce amestecați bine conținutul celei de-a doua eprubete, luați a treia eprubetă și transferați șase părți ale substratului în ea cu o buclă din a doua. Conținutul eprubetei se toarnă într-o cană, iar conținutul eprubetei, după amestecare, se toarnă într-o cană. Cupele cu mediu sunt incubate într-un termostat la 28°C, după câteva zile bacteriile conținute în materia primă formează colonii.

Creștere în serie. Dacă, de exemplu, este necesară izolarea bacteriilor din sol, atunci se utilizează diluția în serie. Mediul nutritiv steril (15 ml per farfurie) se toarnă în vase, 0,1 ml din ultimele trei diluții ale suspensiei se aplică pe agarul întărit și se întinde pe suprafață cu o spatulă de sticlă.

Pentru a izola bacteriile, 1 g de sol se suspendă în 9 ml de apă, se agită bine, se lasă să stea câteva secunde, iar din suspensie se prepară diluții în serie. Cu această metodă, se poate determina numărul de microorganisme din fiecare probă.

Dacă găsiți o eroare, evidențiați o bucată de text și faceți clic Ctrl+Enter.