Ертегілер

ДНҚ репликациясын реттейтін мембраналар. ДНҚ репликациясының реттелуі. ColE1 плазмидалық репликациясының реттелуі

ДНҚ репликациясын реттеудің молекулярлық механизмдерін егжей -тегжейлі қарастыру бұл кітаптың шеңберінен тыс, сондықтан біз бұл мәселеге қатысты бірнеше түсініктеме берумен шектеліп, E. coli репликациясының реттелу механизмін толығырақ талқылайтын боламыз. бактериялық жасушалардағы плазмидалық векторлардың жұмысымен тікелей байланысты бактериялық плазмидалар.

ДНҚ синтезі жасушалық бөлінуді дайындайтын басқа процестермен тығыз байланысты, өйткені қажетті генетикалық ақпаратты ата -аналық жасушалардан қыз жасушаларына беру ұрпақ жасушалары үшін өте маңызды. Артық генетикалық ақпараттың болуы жасушалардың өміршеңдігіне теріс әсер етеді, ал оның жетіспеушілігі ДНҚ -ның жеткіліксіз репликациясынан туындайды, өмірлік гендердің болмауына байланысты өлімге әкеледі. Алайда, генетикалық ақпаратты ата -аналық жасушалардан эукариоттардағы жасушалық жасушаларға беру тек хромосомалық ДНҚ репликациясымен шектелмейді. Сонымен, көптеген түрлердің жәндіктері үшін алыптың болуы саясибастапқы хроматидтердің ДНҚ репликациясының бірнеше раунды нәтижесінде пайда болатын хромосомалар, олардың дивергенциясымен жүрмейді.

СаясаттандыруХромосомалар селективті репликациямен байланысты генетикалық құбылыстардың кең тобын білдіреді. анимация) немесе эукариоттардың жеке генетикалық локустарының жеткіліксіз репликациясы. Бұған жарқын мысал - жануарлардағы рибосомалық РНҚ гендерінің санының өзгеруі. Қосмекенді ооциттердегі рРНҚ гендерінің күшеюі олардың дөңгелек рибосомалық (р) ДНҚ молекулалары түріндегі хромосомадан тыс (хромахромадан тыс) көшірмелерін қалыптастыру арқылы жүреді, содан кейін олар «айналмалы сақина» механизмімен қайталанады. Бұл жағдайда әр ұяшықта жүздеген рДНҚ қайталануының біреуі ғана күшейтіледі, осылайша рДНҚ -ның бір рет қайталануының күшеюі басқалар үшін қандай да бір жолмен амплификация процесін басады, ал бір ооцит нәтижесінде пайда болған барлық қайталанулар бірдей, бірақ жиынтықтардан ерекшеленеді. басқа ооциттердің күшейтілген рДНҚ -лары. Қатаң кезеңдік және ұлпалық спецификалық, сонымен қатар рДНҚ-ның тек бір қайталануының селективті күшеюі бұл жағдайда да репликация процесінің нәзік реттеуші механизмдерінің болуын көрсетеді.

Гендердің селективті репликациясына байланысты көбеюінің типтік мысалдары ұлғайтурРНҚ гендері және жасушалардың дәрілік заттарға төзімділігін анықтайтын гендер санының өзгеруі. Бірінші жағдайда, Дрозофиладағы рРНҚ гендерінің бірнешеуінің жойылуы нәтижесінде олардың санының біртіндеп қалпына келуімен бірге жүреді, ал екінші жағдайда уытты заттың селективті әсеріндегі жасушаларда. дәрілік өнім, оны бейтараптандыру үшін қажет ген көшірмелерінің саны артады. Атап айтқанда, бұл метотрексат бар дигидрофолат редуктаза геніне тән. Мұндай гендердің көшірмелер санының өзгеруі біркелкі емес өту механизміне негізделген деп болжанады.

Бактериялық хромосомалардың репликациясы жасушалық метаболизммен тығыз байланысты. Мысалы, репликацияның жаңа кезеңдерінің басталу жиілігі бактериялық жасушалардың өсу жылдамдығына байланысты, ал тез өсіп келе жатқан бактериялардың жасушаларында бірнеше жұмысшы репликативті шанышқылары бар хромосомалар болуы мүмкін, дегенмен олардың біреуі тек бір бактериялық хромосоманы қайталауға қажет. репликацияның (ори) біркелкі шығу тегі мен қарама -қарсы бағытта бөлінуі. Бұл бактерияларға қолайлы жағдайларда бактериялық хромосоманың толық репликациясына қарағанда, ұрпақ үшін аз уақыт жұмсауға мүмкіндік береді. Әлбетте, репликацияның қатаң реттелген сипатын сақтау үшін репликацияны жаңа раундтарды бастау деңгейінде реттеудің тамаша механизмдері болуы керек. Мұндай механизмдер бар.

Қазіргі уақытта E. coli -дегі ДНҚ синтезін реттеудің ең жақсы зерттелген механизмдері, соның ішінде E. coli ColE1 шағын плазмидасындағы көшірме санын бақылау механизмдері, бұл құбылыстардың маңыздылығына байланысты төменде толығырақ талқыланатын болады. генетикалық инженерия.
^

4.2.1 E. coli -де ДНҚ репликациясының басталуы мен реттелуі

Хромосомалық ДНҚ -ның бактериялардағы репликациясы олардың өмірлік циклінде шешуші рөл атқарады. Бұл процесте микроорганизмдер өздерінің геномын қайталайды, содан кейін пайда болған қыз геномдары қыз жасушаларына ауысады. Бактериялардың мұндай процестерді жоғары дәлдікпен жүргізуі оларды үйлестіру мен бақылаудың арнайы механизмдерінің болуын көрсетеді.

^ Репликацияның басталу аймағының құрылымы oriC. E. coli хромосомасында бір синглы бар репликацияны бастау аймағы(шыққан жері) деп аталады oriCрепликация басталған (I.47 -сурет, а). Хромосоманың автономды репликациясын қамтамасыз ететін репликация басталуының минималды аймағының өлшемі 258 а.к. (I.47 суреттегі 11-268 позициясы). Әр түрлі энтеробактериялардың репликация инициативті аймақтарының бастапқы құрылымдарын салыстыру олардың тізбектері ДНҚ сегменттері әр түрлі орналасқан, бірақ сақталған қысқа сақталған аймақтармен ұсынылғанын көрсетті. Сақталған аймақтар реттеуші белоктардың аралықтар тізбегімен бөлінген байланыстырушы орындары болып шықты. OriC DnaA-қораптар деп аталатын DnaA (палиндромдық емес қайталаулар) байланысатын 9-нуклеотидті инициатордың бес консенсусы бар. Барлық энтеробактерияларда репликацияның шығу аймақтарында 9-14 GATC торабы бар, олардың сегізі сақталған.

Сол жақта oriCАТ-ға бай үш аймақ бар, олардың әрқайсысы GATC-ден басталатын 13 нуклеотидтер бар. AT кластері де осында орналасқан, ол сол 13-нуклеотидтер тізбегімен бірге тұрақсыз ДНҚ спиралінің аймағын құрайды ( ДНҚ ашатын элемент). ДНҚ -ның бұл бөлігін нуклеотидтердің ұқсас құрамы үшін функциясын жоғалтпай ауыстыруға болады, бірақ нуклеотидтер тізбегі басқа.

OriCқұрамында ДНҚ, IHF (интеграциялық хост факторы) және FIS (инверсиялық стимуляция факторы) майысатын ақуыздар үшін байланысатын сайттар бар. Екі ақуыз да DnaA бастамашысына ДНҚ -ны ашуға көмектеседі.

Ішкі бірліктерден тұратын димерлік ақуыз IciA молекулалық салмақ 33 кДа, AT-бай 13 мерді қайталауға арнайы байланыстырады. Бұл ақуыздың қызметі белгісіз, Роб ақуызының функциясы, ол R4 DnaA қорабының оң жағындағы 26-нуклеотидті тораппен арнайы әрекеттеседі. Роб алаңының жанындағы ДНҚ иілуді көрсетеді, ол Дам метилтрансферазамен толық метилденген молекулаларда айқынырақ көрінеді (төменде қараңыз). Бұл толық метилденген ДНҚ-лармен байланысатын жері Роб торабымен қабаттасатын H-NS гистон тәрізді ақуыз әрекеттеседі. Бұл өзара әрекеттесу оның жұмысына әсер етеді oriC.

Күріш. I.47. E. coli хромосомасының репликациясының шығу аймағының құрылымы а) және оның репликациясын бастау схемасы ( б)

HobH-ақуыз, ДНҚ-ның бір тізбекті метилденген байланысымен байланысады
^ DnaA ақуызының қызметі. DnaA протеині жинауда шешуші рөл атқарады репликомалар- екі жақты ДНҚ синтезін жүзеге асыратын көп компонентті ақуыз кешені. Ақуыз репликацияның пайда болуын таниды және репликалардың ақуыздық компоненттерінің қалған бөлігін жинақтау орнына тартады.

^ ДНҚ синтезінің басталу кезеңдері oriC. Ассамблея түпнұсқа күрделі DnaA ақуызының DnaA қораптарымен R1 - R4 және M әсерлесуінен басталады (I.47 суретті қараңыз, б). Репликативті жинаудың келесі сатыларынан сәтті өту үшін DnaA ақуызы АТФ -мен комплекстеліп, суперкапсуламен әрекеттесуі керек. oriC. Электронды микроскоптың көмегімен бастапқы комплексті құрамында 20 DnaA мономерлері бар ықшам эллипсоидты құрылым ретінде анықтайды. oriC. Бастапқы кешен жоғары реттелген құрылымға ие.

АТФ жоғары концентрацияда болғанда (5мМ) бастапқы комплекс түрлендіріледі ашық кешен... Бұл кешенде сол жақта орналасқан AT-бай 13-нуклеотидті қайталаулардың ішінара ашылуы болады oriC... 37 ° C немесе одан жоғары температурада бір DnaA ақуызы ДНҚ -ның ашылуын қамтамасыз ете алады. Ашық комплексті төменгі температурада қалыптастыру үшін HU құрылымдық ақуыздың немесе IHF қабылдаушы бактерияның интеграциялық факторының қатысуы қажет. Ашық кешенде ДНҚ -ның кішкене бөліктері оң жағында орналасқан oriC DnaA жәшіктері арасында R2 және R4, олар геликазаны қону алаңдары болып саналады.

DnaB ақуызы репликативті шанышқының геликазасы болып табылады және ашық комплекске енеді дайындық кешені I.жартылай ашылмаған ДНҚ-ның бір тізбекті аймақтарымен әрекеттесу арқылы. Бұл тораптар SSB протеинін тиісті орындардан ығыстыратын DnaA ақуызымен дайындалады. DnaB алдын ала дайындық кешеніне гексамер түрінде кіреді, олардың әрқайсысы бір АТФ молекуласын байланыстыратын алты DnaC мономері бар кешен құрады. Бұл кешенде DnaB ақуызының геликазалық белсенділігі бұғатталған. DnaC -тың комплекстен шығуы АТФ гидролизінің нәтижесінде жүреді. Мұның салдары - DnaB геликазасының активтенуі және оның кешенде дұрыс орналасуы. Бұл оқиғалардың комбинациясы алдын ала дайындалған I кешенге айналады дайындық кешені II.

Helicase оң жақтағы репликативті шанышқының басында жұмыс істей бастауы керек oriC DnaA қораптарының жанында R2, R3 және R4. Ол үшін оны кешенге алғашқы кірген жерінен репликацияның шыққан жеріне дейін транслокциялау керек. Транслокация комплекстен DnaC ақуызының АТФ-тәуелді бөлінуімен байланысты деп болжанады, ол геликазаның активтенуімен жүреді.

V толтыру кешені Helicase DnaB DnaG-примазамен әрекеттеседі, ол репликацияның дәл басталуын қамтамасыз етуде шешуші рөл атқарады. oriC... Бұл екі фермент қарама -қарсы бағытта қозғалатын екі репликативті шанышқының жұмысының конъюгациясын қамтамасыз етеді. Жасушасыз жүйеде примазалардың төмен концентрациясында репликация бір бағытты болады және оны қосуға болмайды. oriC... Прайминг кешенінде DnaA ақуызының болуы енді қажет емес, ал комплекстен шыққаннан кейін оны екінші репликацияны бастау үшін қайта пайдалануға болады. oriC... Екі репликациялық шанышқыны келісілген құрастыру кезінде олардың бірінде праймер синтезделеді, ол жетекші жіп екінші репликативті шанышқы қарсы бағытта қозғалатын кезде праймер болады. Примаза комплексінде таралу механизміне сәйкес қызмет етеді. Праймер синтезінен кейін ол репликациялық шанышқыны қалдырады және келесі Оказаки фрагментінің қалыптасуы кезінде жаңа примаза молекуласымен алмастырылады.

Әрбір репликативті шанышқыларда репликация пайда болған кезде праймерлердің 3 'ұштарымен байланысқан ДНҚ полимераз III холиноэнзимінің димерлік кешенінің АТФ-ға тәуелді түзілуі пайда болады (сырғымалы қысқыш, жоғарыдан қараңыз). ДНҚ тізбектері. жасушасыз жүйе, жетекші синтездің бастапқы нүктелері oriC DnaA қораптарының жанында R2, R3 және R4.

^ In vivo репликацияның инициациясын бақылау механизмдері. E. coli -де ДНҚ репликациясының басталуы кем дегенде үш деңгейде реттеледі: 1) инициация жасушалық циклмен синхрондалады; 2) жасуша циклінде репликацияның шығуының әр аймағында ДНҚ синтезі бір рет қана басталады; 3) инициация белгілі бір бактерия жасушасында болатын репликацияның шығуының барлық аймақтарында синхронды түрде жүреді. ДНҚ синтезі репликацияның бір аймағындағы бактериялық жасушаның массасы белгілі бір мәнге жеткеннен кейін басталатыны анықталды. жаппай бастама(инициация массасы). Қазіргі уақытта DnaA ақуызы репликацияның басталуын бақылауда шешуші рөл атқаратын негізгі кардиостимулятор (кардиостимулятор) болып саналады.

Ақуыз синтезін in vivo басу инициацияның жаңа раундтарының аяқталуы аясында ДНҚ синтезінің басталуымен бірге жүреді. Ақуыз синтезінің қалпына келуі бір жасушаның артта қалу кезеңінен кейін репликацияның басталуына әкеледі. Барлық қажетті ақуыздар болған кезде инициация рифампинге сезімтал, бактериялық РНҚ -полимеразаның арнайы ингибиторы, бұл инициацияның аударылмаған РНҚ синтезіне тәуелділігін көрсетеді.

OriC топологиясының репликацияны бастаудағы рөлі . Топоизомераза I мен топоизомераза II (ДНҚ -гираза) бактериялардың хромосомасын теріс суперкаперлі күйде сақтайды. Суперқаптардың жартысына жуығы HU, IHF және FIS тәрізді гистон тәрізді ақуыздармен бейтараптандырылады, ал қалған бактериялық хромосоманың суперқапталуы транскрипцияны, репликацияны және сайтқа тән рекомбинацияны жеңілдетеді. Бактериалды хромосома 40-50 супер оралған доменнен тұрады деп болжануда, кб үшін 25 супер орамасы бар. ДНҚ. Қазіргі уақытта топологиялық күй туралы нақты деректер жоқ oriC E. coli репликациясын бастау үшін қажет. Топоизомераза геніндегі мутациялар белгілі жоғарғы А.температураға сезімтал мутацияларды басады dnaA(Ц)... Бұл мутантты штаммдарда топология деп есептеледі oriC DnaA ақуызының жасушаішілік концентрациясында репликацияны бастауға мүмкіндік беретін етіп өзгертілген. Сонымен қатар, белгілі бір топологиялық күйдің маңызы oriCинициация гені өзгерген мутантты бактерияларда инициацияның бұзылу фактісін көрсетеді gyrB(Ц)ДНҚ-гиразаның В-бөлімшесін кодтайды.

Транскрипция арқылы репликацияны белсендіру. Құрамында минихромосомалар немесе плазмидалар бар oriC, олардың репликациясын бастау үшін жеткіліксіз, инициация жақын жерде ДНҚ -ның бір мезгілде транскрипциясы кезінде пайда болуы мүмкін. oriC... Топологияның өзгеруі oriCбұл жағдайда оны қалыптастыруға байланысты жүргізуге болады R-ілмектер(ДНҚ-қос тізбекті ДНҚ гибридті РНҚ) немесе транскрипция нәтижесінде, РНҚ полимеразасын транскрипциялаудан бұрын ДНҚ-ның жергілікті оң суперқабаты, одан кейін теріс. Бұл ДНҚ синтезін бастаған кезде ашық кешендердің түзілуін жеңілдетеді.

^ Ақуыздың рөліDnaAрепликацияның басталуын реттеуде.~ 60 минут бактериялардың хромосомалық ДНҚ -ны репликациялауы, қыз хромосомаларын бөлуі және жаңа бөлінуге дайындалуы үшін қажет. Демек, генерация уақыты осы кезеңнен қысқа (мысалы, бай температурада жоғары температурада) жасушалар қоректік орталар) репликацияның алдыңғы кезеңі аяқталғанға дейін келесі бөлімдерге арналған хромосомалардың репликациясын бастауы керек. Осылайша, бір жасушада бірнеше репликацияның шығу тегі бар репликациялық хромосома болуы мүмкін. Бұл жағдайда бірнеше репликацияны бастау ауқымында репликацияның басталуы бір мезгілде болады.

Бактерияларда DnaA -ның шамадан тыс өндірілуі ДНҚ синтезінің жалпы жылдамдығын өзгертпестен репликацияның басталу жиілігінің күрт өсуіне әкеледі, бұл DnaA -ны осы процестің оң реттегіші ретінде көрсетеді. DnaA ақуызының реттеуші әрекетінің механизмін түсіндіретін модельдердің ішінде DnaA титрлеу моделі ең кең таралған. Бұл модельге сәйкес барлық жаңадан синтезделген DnaA ақуызы DnaA қораптарымен байланысады (титрленеді) oriCхромосомалар. Инициатор молекулаларының саны жасуша ішіндегі DnaA қораптарының санынан асқан кезде (барлық DnaA қораптарын ақуыз алады) ДНҚ синтезі басталады. Бір іске қосуды бастағаннан кейін oriC DnaA молекулаларының шығарылуы, оның жасушаішілік концентрациясының күрт жоғарылауы және репликацияның басқа қол жетімді аймақтарында ДНҚ синтезінің синхронды басталуы байқалады. Сонымен қатар, біріншісінің мембраналарымен байланыс oriCоны қалпына келтіру кезінде қолданудан қорғайды.

ДНҚ синтезінің басталуындағы бөгет метилизациясының рөлі. Жоғарыда айтылғандай, E. coli Dam метилтрансфераза 5'-GATC тізбегіндегі аденин қалдықтарын өзгертеді.Репликация нәтижесінде ДНҚ молекуласы уақытша толық метилденген молекуладан бір жіп бойымен метилденген затқа айналады, бұл жасушаға мүмкіндік береді. жаңадан синтезделген ДНҚ-ны тану, кластерлердің орналасуы oriC Enterobacteriaceae өте консервативті (I.47 суретті қараңыз, а). Бөгет мутант жасушаларындағы метилденбеген немесе жартылай метилденген плазмидті ДНҚ репликацияланбайды, дегенмен ол жасушасыз репликация жүйесінде субстрат қызметін атқарады. Дамба мутанттарында хромосомалық ДНҚ репликациясы басталады oriCалайда, репликация бақылауы бұзылады, ол асинхронды репликацияда көрінеді oriC. Тек жартысы метилденген, бірақ толық метилденбеген немесе метилденбеген oriC-ДНҚ in vitro жағдайында E. coli мембраналық фракциясымен арнайы байланысады. Сонымен қатар, тез өсіп келе жатқан жасушаларда generation 1/3 ұрпақтық уақыт oriC-ДНҚ жартылай метилденген күйде болады, содан кейін ол толық метилденеді. Бұл DnaA инициаторының гендік промоутеріне тән, онда жартылай метилденген күй геннің транскрипциясын басумен байланысты. Керісінше, қалған бактериялық хромосоманың ДНҚ тізбегінің жаңадан синтезделуі тез жүреді - 1-2 минут ішінде. Деректердің осы түріне сүйене отырып, метилденбеген күйде жоғарыда аталған тізбектер реттеуші белоктармен байланысқан бактериялық мембраналар арқылы скринингтен өтеді және репликацияның қайталану кезеңіне қатыса алмайды деген болжам бар. тұтылу). Гендік мутациялар seqAтұтылу уақытын күрт қысқартады, бұл репликация инициализациясының асинхрониясында көрінеді. SeqA ақуызы өзара әрекеттесу сатысында әрекет ететін репликация бастамасының теріс реттеушісі болып шықты oriCбактериялық мембраналармен.

^ SeqA ақуызының бактериялық хромосомалардың репликациясын реттеудегі рөлі. Джин seqA ұзындығы 181 амин қышқылының қалдықтары бар белокты кодтайды, оның белсенділігі бактериялық жасушалар үшін өлімге әкеледі. Бұл ақуыздың полиакриламидті гельде электрофорез кезінде репликация әдісімен репликацияның шығуының метилденбеген, жартылай және толық метилденген аймақтарымен өзара әрекеттесуін зерттеу оның ішінара метилденген тізбектерге артықшылықты байланысын көрсетті. Алайда, оның өзара әрекеттесуінің толық (контекстке тәуелді) ерекшелігі үшін қосымша факторлардың болуы қажет. Шынында да, ішінара метилденген тізбектердің қатысуымен түзілген ДНҚ-ақуыздық кешендердің құрамында oriC, 24 кДа молекулалық ақуыз табылды, ол метилденген ДНҚ тізбегімен ерекше әрекеттеседі. oriC... E. coli клон кітапханасының скринингі генді клондау мүмкіндігін берді hobH (гемиметилденген шығу тегі байланыстырушы) осы ақуызды кодтайды. Бұл геннің мутациясы репликацияның басталуында бактериялық жасушалардың синхронизациясының ішінара жоғалуына әкелді, бұл сонымен қатар HobH ақуызының жасушалық циклдің бастапқы кезеңінде бактериялық хромосомалардың репликациясының басталуын реттеуге қатысуын жанама түрде көрсетеді. Алайда, бұл ақуыздың репликациядағы шынайы рөлі толық түсінілмеген.

Тұтылу кезеңі метилденген жартылай метилденудің біртіндеп аяқталуы нәтижесінде аяқталуы мүмкін oriCмембраналармен біріктірілген. Бұл тізбектердің толық метилденуі олардың мембраналармен әрекеттесуіне жол бермейді және оларды DnaA инициаторына қол жетімді етеді.

^ Репликацияны тоқтату. Бактериалды хромосоманың репликация циклінің соңында екі репликациялық айырдың кездесуі жасушалардың бөлінуіне дейін пайда болған екі бактериялық хромосоманың толық бөлінуіне қажетті бірнеше оқиғалармен бірге жүреді. Репликативті шанышқылардың бір -біріне қарай жылжуы қыз хроматидтері арасындағы гомологиялық рекомбинациямен жүреді. Егер пайда болған рекомбинациялардың саны тақ болса, бактериялық хромосоманың димері түзіледі, ал рекомбинацияның жұп санында екі катенирленген (бір -бірімен байланысқан) хромосомалар пайда болады. Екінші жағдайда, топоизомераз IV көмегімен катенандардың бөлінуі қыз хромосомаларының толық бөлінуіне әкеледі, ал бактериялық хромосома димерінде бұл жеткіліксіз. Димердің мономерлердің пайда болуымен бөлінуі локустағы учаскеге тән рекомбинация нәтижесінде болады. дифрезерввазаның әсерінен (сайтқа тән рекомбиназа) XerCD.
^

4.2.2 ColE1 плазмидтік репликациясын реттеу

Көптеген прокариот жасушаларында негізгі хромосомадан басқа, хромосомадан тыс шағын ДНҚ бар плазмидалар... Плазмидалар, олардың мөлшері бірнеше мыңнан жүздеген мыңға дейін өзгереді және бір жасушадан көшірмелердің саны - бірнеше жүзге дейін, автономды (негізгі хромосомаға тәуелсіз) репликацияға қабілетті және тұрақты түрде тұқым қуалайды. жасуша буындарының саны. Көптеген плазмидалар қабылдаушы жасушаларға елеулі селективті артықшылықтар бергенімен (антибиотиктерге, ауыр металдарға және т.б.) олардың көпшілігі құпия, яғни жасушалардың көрінетін фенотипінде көрінбейді. Олардың тіршілік етуі жасуша метаболизміне айтарлықтай ауыртпалық болғандықтан, олардың эволюциялық тұрақтылығының мәні түсініксіз болып қалады. Табиғи жағдайда бактериялық жасушалар жасушалар ішіндегі плазмидаларды сақтауға бағытталған іріктеу қысымына ұшырамайтынына қарамастан, екіншісі жасушалардағы олардың көшірме санын реттейтін нәзік механизмдерді қолданып, бактериялық жасушалар арасында тұрақты түрде бөлініп тұрады.

Колицинге төзімділікке арналған гендерді тасымалдайтын ColE1 шағын плазмидасының репликациясының шығу тегі генетикалық инженерияда дәстүрлі түрде E. coli жасушаларында қысқа нуклеотидтер тізбегін клондау және білдіру үшін қолданылатын векторлы ДНҚ молекулаларын құру үшін қолданылады. Сондықтан ColE1 плазмидасының репликациясын бақылау механизмдерін қарастырған жөн.

^ ColE1 плазмидасының репликациясының бастамасы. ColE1 плазмидасының репликациясы иесінің жасушасының репликативті аппараты көмегімен бір бағытта жүреді (бір бағытты репликация). Плазмида өздігінен оның репликациясы үшін қажет болатын бір ферментті кодтамайды. Репликацияның шығу тегі екі промотордан тұрады, олардың біреуі плазмидалық репликацияны бастау үшін қажет РНҚ праймерінің (РНҚ II) синтезін қамтамасыз етеді. Ұзындығы репликацияланатын плазмиданың түріне байланысты синтезделген II РНҚ -ны одан әрі РНаза Н өңдейді, РНҚ 550 нуклеотидтерін құрайды. Бұл молекуланы ДНҚ полимеразасы І ДНҚ жетекші синтезінде праймер ретінде тиімді қолданады. РНаза Н болмаған жағдайда РНҚ ІІ -нің 3 'ұшы репликация кезінде праймер қызметін атқарады, бірақ тиімділігі төмен. RNase H және ДНҚ полимеразасы ақаулы жасушаларда ColE1 репликациясы жоғарыда егжей -тегжейлі сипатталған механизм бойынша ІІ РНҚ қатысуымен ДНҚ полимеразасы III арқылы басталады.

Плазмидалық репликация инициациясының барлық үш механизмі репликацияның шыққан аймағында тұрақты ДНҚ - РНҚ гибридін қалыптастыру үшін II РНҚ бірегей қасиетіне негізделген. Шынында да, қалыпты транскрипциялар транскрипция аяқталғаннан кейін және шаблоннан РНҚ -полимеразаның бөлінуінен кейін транскрипция кешенінен шығарылады, бұл РНҚ ІІ -де болмайды. Репликацияда ақаулы плазмидалық мутанттарды, сондай-ақ олардың ревертанттарын талдау, шаблонмен РНҚ II тұрақты гибридінде репликацияның басталу нүктесінен жоғары 265 нуклеотид түзілген G-бай РНҚ II циклінің арасында өзара әрекеттесу жүретінін көрсетті. ) және нуклеотид -20 маңында орналасқан С -ға бай аймақ ДНҚ (I.48 -сурет, а). Бұл тізбектердің екеуі де байланысты pMB1, p15A және KSF1030 плазмидаларында сақталғаны анықталды. Көрсетілген тізбектердің өзара әрекеттестігі, РНҚ -полимераза әлі де транскрипциялық кешенде болған кезде және комплекс маңындағы ДНҚ тізбектері ашылмаған кезде пайда болады. РНҚ II -нің екі альтернативті конформациясы арасындағы тепе -теңдік плазмидалық репликацияны бастау үшін қажет ДНҚ - РНҚ гибридінде қалған РНҚ молекулаларының үлесін анықтауда маңызды. РНҚ II -нің екі альтернативті конформациясы арасындағы таңдау нуклеотидтер –359 мен –380 арасында орналасқан аймақтың бастапқы құрылымымен анықталады (sequence ретін қараңыз). б). Бұл реттілік жоғарыда келтірілген қосымша құрылыммен ( құрылымы) немесе төменде орналасқан гомологиялық реттілікпен interact өзара әрекеттесе алады (құрылым ). РНҚ-полимераза алғашқы 200 нуклеотидті транскрипциялағаннан кейін, нәтижесінде пайда болатын II РНҚ уақытша екіншілік құрылымды құрайды, ол үш бағаналы ілмек доменінің болуымен сипатталады (I, II және III). РНҚ II -нің тағы бірнеше нуклеотидтермен созылуы III сабақтың бұзылуына және IV сабағының пайда болуына әкеледі, ол реттілік пен. РНҚ II -нің кейінгі созылуы кезінде оның екінші реттік құрылымын құрудың екі балама мүмкіндігі бар. Бір немесе басқа конформация пайдасына таңдау  тізбегінің  тізбегімен байланысты болып қалуына немесе реттілікпен жаңа контактілер құруына байланысты. Комплементарлы жұптардан  -ге көшу ақыр соңында плазмидалық репликация кезінде праймер қызметін атқару қабілетін анықтайтын II РНҚ конформациясының күшті өзгерістерімен жүреді. R конформациясындағы II РНҚ молекулалары RNase H үшін субстрат ретінде қызмет ететін РНҚ - ДНҚ гибридін құра алады, бірақ  конформациясында олар болмайды. Ұсынылған модель, ең алдымен, IV сабағының тұрақсыздығына байланысты  конформациясының түзілуін қолайлы ететін мутациялар II РНҚ -ның праймер ретінде жұмыс істеуіне кедергі келтіретіндігімен және олардың санының азаюымен расталады. бактерия жасушаларының ішіндегі ColE1 плазмидасының көшірмелері. Мұндай репликацияда ақаулы мутантты плазмидалар IV сабақты тұрақтандыратын супрессорлық мутациялар арқылы активтенеді. Осылайша, ColE1 плазмидасының репликациясының басталуы РНҚ II -нің РНҚ - ДНҚ гибридін репликацияның басталуына жақын (ori) қабілеттілігіне байланысты. Бұл жағдайда гибридтің пайда болуына екіншілік және үшінші құрылымпраймердің нуклеотидтер тізбегінің жоғары ағымы.

^ Күріш. I.48. ColE1 плазмидасының репликациясын реттеу

а- РНҚ полимераза trans 500 плазмидті ДНҚ -ның нуклеотидтерімен транскрипциясынан кейін II РНҚ -ның болжамды екіншілік құрылымы; РНҚ II -нің одан әрі ұзаруы ДНҚ - РНҚ II мен транскрипцияланған ДНҚ арасында гибридті РНҚ (қою көрсеткі) пайда болуымен жүреді;

б- плазмидалық репликацияны басқарудың мүмкін механизмі. Суреттің жоғарғы бөлігінде ДНҚ плазмидалық репликациясын бастау және бақылау үшін қажетті ДНҚ аймағының генетикалық картасы көрсетілген. Плазмидалық репликацияның екі ингибиторының кеңістіктік құрылымдары: РНҚ I мен Роп ақуызы схемалық түрде көрсетілген. Төменгі бөлімде РНҚ I, I - X әсерінен пайда болған РНҚ II -нің екі балама конформациясы көрсетілген - екіншілік құрылым элементтері
^ ColE1 плазмидалық көшірме санын басқару. ColE1 плазмидасының репликациясының басталуын бақылау негізінен РНҚ II кеңістіктік құрылымының өзгеру деңгейінде жүзеге асырылады. Плазмидалар өздерінің биосинтезін басқаратындықтан, б.а. олардың репликациясы автокаталитикалық механизммен жүреді; ColE1 репликациясының басталуы жасушада концентрациясы неғұрлым жоғары болса, плазмиданың жасушаішілік көшірмелерінің саны соғұрлым көп болатын плазмидамен кодталған ингибитордың әсерінен болады деп болжалды. . Шынында да, жоғары көшірме санымен сипатталатын мутантты плазмидалардың репликациясының механизмдерін талдау олардың екеуін анықтауға мүмкіндік берді. транс-плазмидамен кодталған және плазмиданың in vivo репликациясына әсер ететін әрекет етуші фактор.

Репликацияның негізгі ингибиторы праймерді прекурсордың (РНҚ II) 5'-терминалды тізбегіне толықтай сәйкес келетін, ұзындығы РНК I деп аталатын кішкентай РНҚ 108 нуклеотидтері болды. РНҚ I ген промоутері ColE1 плазмидасының репликациясы шыққан аймақта орналасқан және РНҚ II промоторына қатысты қарама -қарсы бағытталған (I.48 суретті қараңыз). РНҚ I мен РНҚ II арасындағы қосымша өзара әрекеттесу рНҚ II кеңістіктік құрылымының түзілуіне әсер етеді, сондықтан репликацияның басталуына қатысты белсенді емес βγ конформациясы пайда болады (I.48 суретті қараңыз, б, төменгі оң жақта).

РНҚ I мен РНҚ II арасындағы өзара әрекеттесу ұзындығы 80 нуклеотидтен аспайтын қысқа РНҚ II транскрипті синтезделген жағдайда ғана нәтижелі болады. РНҚ I-дің осындай қысқа нуклеотидтер тізбегімен әрекеттесуі ұзындығы 360 нуклеотидтердің транскриптіне қарағанда баяу болса да, соңғы жағдайда I РНҚ II РНҚ-ның 5'-терминалды бөлігінің конформациясына және оның қабілеттілігіне әсер етпейді. плазмидалық репликация кезінде праймер қызметін атқарады (αβ конформациясы, I.48 -сурет, б, төменгі сол жақта). Бұдан РНҚ I мен РНҚ II арасындағы будандардың түзілу жылдамдығы плазмиданың репликациясын реттеу механизмінің тиімді жұмыс істеуі үшін шешуші мән болатыны анық. I РНҚ мен ІІ РНҚ арасындағы өзара әрекеттесу процесі қазір егжей -тегжейлі зерттелді. Ол бірнеше аралық өнімнің түзілуінен өтеді және толық комплементарлы РНҚ I мен РНҚ II 5'-терминалды аймағы арасындағы тұрақты буданда аяқталады.

^ РНҚ ұйымдастыратын ақуыз Rop. ColE1 плазмидасының репликациясын теріс реттейтін екінші компоненттің гені репликацияның шығуының артында бірден бейнеленеді. Бұл ген ерітіндіде димер ретінде бар 63 а.к. ақуызды кодтайды (праймердің репрессоры). In vivo және in vitro жағдайында Rop II РНҚ синтезіне әсер етпей I РНҚ -ның ингибиторлық белсенділігін арттырады. Бұл жағдайда Rop I РНҚ мен РНҚ II арасындағы өзара әрекеттестіктің бастапқы фазаларына әсер етеді, бұл өте тұрақсыз C * аралық өнімінің неғұрлым тұрақты C m * өніміне өтуін жеңілдетеді. Rop ақуызының C * аффинділігі жоғары және in vitro жағдайында оқшауланған РНҚ I мен РНҚ II -мен әлсіз әрекеттеседі. Роп нуклеотидтер тізбегіне қатысты шамалы ерекшелік көрсетеді және олардың өзара әрекеттесуінің алғашқы кезеңінде пайда болатын РНҚ I - РНҚ II кешенінің кейбір жалпы құрылымдық ерекшеліктерін таниды деп болжанады. Осылайша, Rop ақуызының функциялары тұрақсыз РНҚ -РНҚ комплексін тұрақтыға айналдырудан тұрады, бұл өз кезегінде репликацияны бастау үшін қажетті праймер түзілуін басумен бірге жүреді. ColE1 плазмидасы.

Бактериялық плазмидалардың репликациясын бақылау үшін сезімтал РНҚ қолдану - кең таралған тәжірибе. Атап айтқанда, кіші көшірмелі R1 плазмиданың репликациясы оң реттеуші фактор ретінде плазмидалық репликацияның басталуына қатысатын RepA ақуызымен бақыланады. РепА синтезі, өз кезегінде, жоғарыда талқыланған РНҚ I мен РНҚ II арасындағы синтезге ұқсас көп сатылы реакцияда РепА-мРНҚ-мен байланысатын РНҚ CopA антисезімінің шағын транскрипциясымен реттеледі. Бұл өзара әрекеттесу гендердің экспрессиясын басады repAмүмкін, РНҚ ІІІ РНҚ - РНҚ дуплексінің бөлінуіне байланысты. Клетка ішілік концентрациясы CopA-РНҚ R1 плазмиданың көшірме санына тура пропорционалды. Стафилококк aureus pT181 плазмидасының репликациясының басталуын реттеу үшін ұқсас механизм сипатталған.

Бактериялық векторларды гендік инженерияға дайындауда, олардың көпшілігінде ColE1 плазмидасының репликациясының шығу тегі бар, ақуыз биосинтезінің ингибиторлары, атап айтқанда хлорамфеникол, бактерия жасушаларында олардың көшірме санын көбейту үшін жиі қолданылады. Осы плазмиданың репликациясын бақылауды реттеу тетіктерін талқылағаннан кейін, бұл техниканың негізіне алынған қағидалар түсінікті болды. Шынында да, хлорамфениколды қоректік ортаға енгізу бактериялық ақуыздардың биосинтезін блоктайды, оның ішінде РНҚ I әсерінен плазмидалық репликацияның басталуын тиімді басу үшін қажет. бактериялық жасушалардағы плазмидалар бұзылады және олар осы мақсат үшін алдын ала синтезделген бактериялық ақуыздарды қолдана отырып үздіксіз репликациялауды бастайды.

Бір репликацияны басқару механизмін қолданатын фенотиптік жағынан әр түрлі екі плазмиданың бір бактериялық жасушада үйлеспейтіні белгілі. Әр түрлі үйлесімділік тобынан екі плазмидасы бар жасушалар көбею процесінде тез арада екі популяцияны құрайды, олардың әрқайсысында плазмиданың бір ғана түрі бар. Бұл бактериялық жасушалар ішіндегі репликацияға арналған плазмидалардың кездейсоқ іріктелуіне және аналық жасушалар арасында плазмидалардың бастапқы пулының кездейсоқ таралуына байланысты. Антисезімді РНҚ көмегімен бактериялық плазмидалардың репликациясын бақылау механизмінің эволюциялық пайда болуы әр түрлі үйлесімділік топтарына жататын және бір бактериялық жасушада қатар тіршілік ететін плазмидалардың пайда болу мүмкіндіктерін кеңейтті. Шынында да, бір механизмнің қолданылуына қарамастан, нуклеотидтердің әр түрлі тізбегі бар антисезімді РНҚ -лар «бөтен», гетерологиялық РНҚ -ның нысандарын тани алмайды. Бұл мұндай плазмидалардың бір бактериялық жасушада өмір сүруіне мүмкіндік береді және олардың микроорганизмдердің табиғи популяциясында кеңірек таралуына жағдай жасайды.

Гендердің селективті репликациясына байланысты көбеюінің типтік мысалдары ұлғайтурРНҚ гендері және жасушалардың дәрілік заттарға төзімділігін анықтайтын гендер санының өзгеруі. Бірінші жағдайда, Дрозофиладағы рРНҚ гендерінің кейбірінің жойылуы нәтижесінде олардың жоғалуы олардың санының біртіндеп қалпына келуімен бірге жүреді, ал екінші жағдайда оны бейтараптандыру үшін қажет ген көшірмелерінің саны жасуша астындағы жасушаларда артады. олар үшін улы препараттың селективті әрекеті. Атап айтқанда, бұл метотрексат бар дигидрофолат редуктаза геніне тән. Мұндай гендердің көшірмелер санының өзгеруі біркелкі емес өту механизміне негізделген деп болжанады.

Жасушадан тыс биологиялық Жасушаішілік кеңістік Мембраналық кеңістік

Көк жөтел мен парапутураның қоздырғыштары. Олардың қасиеттерінің сипаттамасы. Көк жөтелдің патогенезі. Микробиологиялық диагностика. Арнайы профилактика.

Бактериялардың генетикалық аппараты (хромосомалар, плазмидалар) бактериялық транспозондардың сипаттамасы. Плазмидалардың биологиялық ролі.

ДНҚ репликациясы - ата -аналық ДНҚ молекуласының үлгісінде дезоксирибонуклеин қышқылының қыз молекуласын синтездеу процесі. Аналық жасушаның кейінгі бөлінуі кезінде әрбір аналық жасуша ДНҚ молекуласының бір көшірмесін алады, ол бастапқы аналық жасушаның ДНҚ -сына ұқсас. Бұл процесс генетикалық ақпараттың ұрпақтан ұрпаққа дәл берілуін қамтамасыз етеді. ДНҚ репликациясын репликисома деп аталатын 15-20 түрлі ақуыздан тұратын күрделі ферментативті кешен жүзеге асырады.

Тарихты оқу

Жалпы көзқарастар

ДНҚ репликациясы - жасушаның бөлінуіндегі маңызды оқиға. Бөлу кезінде ДНҚ толық репликацияланып, тек бір рет болуы маңызды. Бұл ДНҚ репликациясын реттеудің белгілі бір механизмдерімен қамтамасыз етілген. Репликация үш кезеңде жүреді:

репликацияның басталуы

созылу

репликацияның тоқтатылуы.

Репликацияны реттеу негізінен инициация сатысында жүзеге асады. Бұл өте оңай, өйткені репликация ДНҚ -ның кез келген бөлігінен емес, репликацияның инициативті орны деп аталатын қатаң анықталғаннан басталуы мүмкін. Геномда мұндай сайттар бір немесе бірнеше болуы мүмкін. Репликация инициативті сайты ұғымымен тығыз байланысты. Репликон - бұл репликацияның инициалды орнын қамтитын және ДНҚ синтезі сол жерден басталған кезде қайталанатын ДНҚ -ның созылуы. Бактериялық геномдар, әдетте, бір репликонды білдіреді, яғни бүкіл геномның репликациясы репликацияның бір бастамасының нәтижесі болып табылады. Эукариоттардың геномдары (сонымен қатар олардың жеке хромосомалары) көптеген жеке репликондардан тұрады, бұл жеке хромосоманың жалпы репликация уақытын едәуір қысқартады. Жасушалардың бөлінуінің бір циклі кезінде әр учаскеде репликацияның басталу санын бақылайтын молекулалық механизмдер көшірме санын бақылау деп аталады. Хромосомалық ДНҚ -дан басқа, бактерия жасушаларында көбінесе жеке репликондар болып табылатын плазмидалар болады. Плазмидалардың көшіруді басқарудың өзіндік механизмдері бар: олар жасуша циклінде плазмиданың бір данасының немесе мыңдаған көшірмелердің синтезін қамтамасыз ете алады.

Репликация ДНҚ -ның қос спиралінің оралуынан репликацияның басталу орнынан басталады, ДНҚ -ның тікелей репликациясы - репликациялық шанышқының пайда болуынан басталады. Әрбір сайт репликацияның бір бағытты немесе екі бағытты болуына байланысты бір немесе екі репликациялық шанышқыны құра алады. Екі жақты репликация жиі кездеседі. Репликация басталғаннан кейін біраз уақыттан кейін электронды микроскопта репликациялық көзді байқауға болады - ДНҚ репликацияланған хромосоманың бөлімі, репликацияланбаған ДНҚ -ның кеңейтілген бөлімдерімен қоршалған.

Репликация шанышқысында ДНҚ негізгі фермент ДНҚ полимераза болып табылатын үлкен ақуыз кешенін (репликисома) көшіреді. Репликациялық шанышқы прокариоттарда минутына шамамен 100000 негізгі жұп жылдамдығымен және эукариоттарда 500-5000 жылдамдықпен қозғалады.

Молекулалық репликация механизмі

Ферменттер (геликаза, топоизомераза) мен ДНҚ байланыстыратын ақуыздар ДНҚ-ны босатады, матрицаны сұйылтылған күйде ұстайды және ДНҚ молекуласын айналдырады. Репликацияның дұрыстығы комплементарлы базалық жұптардың дәл сәйкестігімен және қатені тануға және түзетуге қабілетті ДНҚ полимеразасының белсенділігімен қамтамасыз етіледі. Эукариоттарда репликация бірнеше түрлі ДНҚ полимеразаларымен жүзеге асады. Содан кейін синтезделген молекулалар ДНҚ -ны суперкаптау және одан әрі тығыздау принципі бойынша бұралады. Синтез энергияны қажет етеді.

ДНҚ молекуласының тізбектері бөлініп, репликациялық шанышқыны құрайды және олардың әрқайсысы жаңа комплементарлы тізбек синтезделетін матрицаға айналады. Нәтижесінде ата-аналық молекулаға ұқсас екі жаңа тізбекті екі ДНҚ молекуласы пайда болады.

Репликация процесінің сипаттамасы

матрица - синтезделген ДНҚ тізбегінің реттілігі бір -бірін толықтыру принципіне сәйкес ана тізбегінің реттілігімен бірегей анықталады;

жартылай консервативті - репликация нәтижесінде пайда болған ДНҚ молекуласының бір тізбегі жаңадан синтезделеді, ал екіншісі - аналық;

жаңа молекуланың 5'-соңынан 3'-соңына дейінгі бағытта жүреді;

жартылай үзіліссіз - ДНҚ тізбектерінің бірі үздіксіз синтезделеді, ал екіншісі - бөлек қысқа үзінділер жиынтығы түрінде (Оказаки үзінділері);

репликацияның басталу орны деп аталатын ДНҚ -ның белгілі бөлімдерінен басталады (ағылшын тілінен шыққан).

ДНҚ репликациясының маңызды ферменттері

Ақпарат / ДНҚ репликациясы / ДНҚ репликациясының негізгі ферменттері

ДНҚ полимераза

ДНҚ полимераза - ДНҚ репликациясына қатысатын фермент. Бұл сыныптың ферменттері ДНҚ нуклеотидтер тізбегі бойынша дезоксирибонуклеотидтердің полимерленуін катализдейді, оны фермент «оқиды» және шаблон ретінде пайдаланады. Жаңа нуклеотидтің түрі оны оқылатын шаблонмен толықтыру принципіне сәйкес анықталады. Жиналған молекула моно-спираль үлгісіне қосымша болып табылады және қос спиральдың екінші компонентіне ұқсас.

ДНҚ-ның тізбектерінің бірін шаблон ретінде ДНҚ-ға тәуелді ДНҚ полимеразасы және РНҚ-дан ақпаратты оқуға қабілетті РНҚ-ға тәуелді ДНҚ-полимераза (кері транскрипция) арқылы оқшауланған.

ДНҚ полимеразасы холофермент болып саналады, себебі оның дұрыс жұмыс істеуі үшін кофактор ретінде магний иондары қажет. Магний иондары болмаған жағдайда оны апофермент деп атауға болады.

ДНҚ полимеразасы ДНҚ репликациясын нуклеотид тізбегінің байланысымен бастайды. Матрицамен байланыс / диссоциацияның бір әрекетінде ДНҚ -полимеразамен ферменттер қосылатын нуклеотидтердің орташа саны процестік деп аталады.

ДНҚ лигазалары

Лигаза - жаңа молекуланың қосылуының катализаторы химиялық байланыс(байлау). Бұл жағдайда әдетте кіші химиялық топтың молекулалардың бірінен бөлінуі (гидролизі) жүреді.

Лигазалар EC 6 ферменттер класына жатады.

Молекулалық биологияда лигазалар екі үлкен топқа бөлінеді - РНҚ лигазалары мен ДНҚ лигазалары. ДНҚ қалпына келтіру үшін ДНҚ лигазасы

ДНҚ лигазалары - репликация, жөндеу және рекомбинация кезінде дуплексте ДНҚ тізбектерінің ковалентті байланысын катализдейтін ферменттер. Олар ДНҚ үзілісінде немесе екі ДНҚ молекуласы арасындағы іргелес дезоксинуклеотидтердің 5 «фосфорил мен 3» гидроксил топтары арасында фосфодиэстер көпірлерін құрайды. Бұл көпірлерді қалыптастыру үшін лигазалар АТФ пирофосфорил байланысының гидролиз энергиясын пайдаланады. Коммерциялық қол жетімді ферменттердің бірі - бактериофаг T4 ДНҚ лигазасы.

ДНҚ - геликазалар

ДНҚ геликазалары-бұл НТФ трифосфаттарының гидролизі энергиясын жұмсай отырып, екі тізбекті ДНҚ спиралын босататын ферменттер. Қалыптасқан бір тізбекті ДНҚ репликация, рекомбинация және жөндеу сияқты әр түрлі процестерге қатысады. ДНҚ геликазалары репликация, жөндеу, рекомбинация және транскрипция үшін қажет. Геликазалар барлық организмдерде болады.

ДНҚ топоизомеразасы

ДНҚ топоизомеразалары - бұл суперкаптама дәрежесін және суперкаптама түрін өзгертетін ферменттер. Бір тізбекті үзіліс кезінде олар топсаны жасайды, оның айналасында шанышқының алдындағы ДНҚ дуплексі еркін айнала алады. Бұл екі тізбек репликациялық айырда бұралмаған кезде пайда болатын механикалық кернеуді жеңілдетеді, бұл оның үздіксіз қозғалысының алғы шарты болып табылады. Сонымен қатар, топоизомеразалар (ІІ типті) катенандардың байланысқан дөңгелек ДНҚ (дөңгелек ДНҚ репликациясы нәтижесінде пайда болған) бөлінуін немесе түзілуін қамтамасыз етеді, сонымен қатар ұзын сызықты ДНҚ -дан түйіндер мен шиеленісті шиеленісті жоюды қамтамасыз етеді. Топоизомеразалардың екі түрі бар. I типті топоизомеразалар ДНҚ -дағы суперқапшықтардың санын бір әрекетке азайтады. Бұл топоизомеразалар екі тізбектің бірін кесіп тастайды, осылайша бүйірлік дуплексті аймақтар бүтін жіпті айналдыра алады, содан кейін кесілген жіптің ұштарына қайта қосылады. Бұл реакция АТФ энергиясын қажет етпейді, себебі фосфодиэстер байланысының энергиясы фермент молекуласындағы тирозин қалдықтары не акцептор, не фосфорилдік үзіліс тізбегінің доноры ретінде әрекет ететіндіктен сақталады.

II типті топоизомеразалар қосалқы тізбектердің екеуінде де уақытша үзілістер жасайды, бір немесе басқа ДНҚ молекуласының қос тізбекті сегментін үзілістен өткізеді, содан кейін сынған ұштарды қосады. Нәтижесінде бір әрекетте екі оң немесе теріс суперкаппар жойылады. II типті топоизомеразалар әр үзілген тізбектің 5 'ұшын бір уақытта байланыстыру үшін тирозин қалдықтарын пайдаланады. үзілістен басқа дуплекс өткен кезде.

Примаза

Примаза - РНҚ -полимеразалық белсенділігі бар фермент; ори нүктесінде ДНҚ синтезін бастау үшін қажет РНҚ праймерлерінің түзілуіне қызмет етеді, әрі қарай артта қалған тізбектің синтезі үшін қызмет етеді.

Ата -аналық ДНҚ молекуласына негізделген. ДНҚ репликациясы репликисома деп аталатын 15-20 түрлі ақуыз-ферменттерден тұратын кешенді кешенмен жүзеге асады. (Ағылшын)Арнайы ферменттердің көмегімен аналық ДНҚ -ның қос спиральі екі жіпке бөлінбейді, әрбір түзілген тізбекте екінші бір тізбек аяқталады, олар екі бірдей қыз ДНҚ молекуласын құрайды, содан кейін олар бөлек спиральға айналады. Аналық жасушаның кейінгі бөлінуі кезінде әрбір аналық жасуша ДНҚ молекуласының бір көшірмесін алады, ол бастапқы аналық жасушаның ДНҚ -сына ұқсас. Бұл процесс генетикалық ақпараттың ұрпақтан ұрпаққа дәл берілуін қамтамасыз етеді.

Тарихты оқу

Әрбір ДНҚ молекуласы бастапқы аналық молекуланың бір тізбегінен және жаңадан синтезделген бір тізбектен тұрады. Бұл репликация механизмі жартылай консервативті деп аталады. Қазіргі уақытта бұл механизм Мэттью Меселсон мен Франклин Стальдың тәжірибелерінің арқасында дәлелденген болып саналады. Бұрын басқа екі модель болды: «консервативті» - репликация нәтижесінде тек ата -аналық тізбектерден тұратын бір ДНҚ молекуласы түзіледі, ал біреуі тек қыз тізбектерінен тұрады; «Дисперсиялық» - репликация нәтижесінде алынған барлық ДНҚ молекулалары тізбектерден тұрады, олардың кейбір бөліктері жаңадан синтезделеді, ал басқалары ДНҚ -ның негізгі молекуласынан алынады. ДНҚ молекуласы екіге бөлінеді және екі шаблон пайда болады. Репликациялық шанышқыдан екі шаблон шығады. Егер сіз оларды түзетілген түрде көрсетсеңіз, онда сіз тарақтардың сызғышын көре аласыз, олар ұштарымен байланысқан, бірақ саңылауы бар. Бір тарақ көк, екіншісі қызыл екенін елестетіп көріңіз. Енді біз төменгі қызыл түсті (оның үстіңгісі сияқты бес жотасы бар) бесінші ұшын үшінші жоғарғы (үшінші жоғарғы инеге) ауыстырамыз. Біз тізбекті жоғарыдан да, төменнен де ұзартамыз. Бұл қалай болады: бес, үш, бес және т.б. - жоғарыда да, төменде де. Содан кейін шаблондар (тарақтар) репликациялық шанышқыны қалдырғаннан кейін бұл тарақтарға тағы екі шаблон қосылады. Бір ДНҚ молекуласынан екі бірдей аналық (егер мутациялар болмаса) молекулалар алынады, бұл жартылай консерватизм деп аталады.

Жалпы көзқарастар

репликацияның басталуы
созылу
репликацияның тоқтатылуы.

Репликацияны реттеу негізінен инициация сатысында жүзеге асады. Бұл өте оңай, өйткені репликация ДНҚ -ның кез келген бөлігінен емес, репликацияның инициативті орны деп аталатын қатаң анықталғаннан басталуы мүмкін. Геномда мұндай сайттар бір немесе бірнеше болуы мүмкін. Репликацияны бастау алаңы ұғымымен тығыз байланысты репликон ... Репликон - бұл репликацияның инициалды орнын қамтитын және ДНҚ синтезі сол жерден басталған кезде қайталанатын ДНҚ -ның созылуы. Бактериялық геномдар, әдетте, бір репликонды білдіреді, яғни бүкіл геномның репликациясы репликацияның бір бастамасының нәтижесі болып табылады. Эукариоттардың геномдары (сонымен қатар олардың жеке хромосомалары) көптеген жеке репликондардан тұрады, бұл жеке хромосоманың жалпы репликация уақытын едәуір қысқартады. Жасушалардың бөлінуінің бір циклі кезінде әр учаскеде репликацияның басталу санын бақылайтын молекулалық механизмдер көшірме санын бақылау деп аталады. Хромосомалық ДНҚ -дан басқа, бактерия жасушаларында көбінесе жеке репликондар болып табылатын плазмидалар болады. Плазмидалардың көшіруді басқарудың өзіндік механизмдері бар: олар жасуша циклінде плазмиданың бір данасының немесе мыңдаған көшірмелердің синтезін қамтамасыз ете алады.

Репликация ДНҚ -ның қос спиралінің ашылуымен репликацияның басталу орнынан басталады. репликациялық шанышқы - ДНҚ -ның тікелей репликациясының орны. Әрбір сайт репликацияның бір бағытты немесе екі бағытты болуына байланысты бір немесе екі репликациялық шанышқыны құра алады. Екі жақты репликация жиі кездеседі. Электронды микроскопта репликация басталғаннан кейін біраз уақыт өткен соң байқауға болады репликациялы тесік - репликацияланбаған ДНҚ-ның кеңейтілген бөлімдерімен қоршалған ДНҚ репликацияланған хромосома бөлімі.

Ферменттер және олардың қызметі

Фермент	Функция
ДНҚ -гираза	ДНҚ-да уақытша қос тізбекті үзілістер енгізеді, бұл демалуды жеңілдетеді.
Хеликаза	Қос тізбекті ДНҚ молекуласының тізбектерін бір тізбекке бөледі.
SSB ақуыздары	Бір жіпшелі ДНҚ фрагменттерін байлап, комплементарлы жұптасудың алдын алады.
Примаза	РНҚ праймерін (праймер) синтездейді - РНҚ -ның қысқа фрагменті, ол ДНҚ полимеразасының бастамашысы болып табылады (полимераза ДНҚ -ны нөлден синтездей алмайды, бірақ барларына нуклеотидтерді қосуы мүмкін).
ДНҚ полимераза	Праймермен байланысып ДНҚ синтездейді. Айта кету керек, полимераза аналық ДНҚ -ның бір ұшын үздіксіз және бір бағытта, ал екіншісін қарама -қарсы бағытта фрагменттерде синтездеген.
Қысқыш протеиндер (бекіткіштер)	Олар ДНҚ -ны сақинамен қоршап, ДНҚ полимеразалық ферментімен бірге оның бойымен «сырғып» өтеді. Олар ДНҚ матрицасынан ферменттің диссоциациясын болдырмайды және оның тиімділігін арттырады.
РНаз Х	РНҚ-праймердің қажет емес фрагменттерін жояды.
ДНҚ лигазасы	ДНҚ фрагменттерін тігеді (Оказаки фрагменттері).
Теломераза	Теломер аймақтарындағы ДНҚ тізбегінің бір ұшына қайталанатын нуклеотидтер тізбегін қосады, осылайша олардың бөліну кезінде қысқаруын өтейді.
Қайта шығару (барлық репликация ферменттерінің кешені)	Ол ДНҚ матрицасының молекуласы бойынша қозғалады, оны ашады және ДНҚ -ның қосымша тізбектерін құрады.

Спивак Ирина Михайловна

ДНҚ репликациясы

Кіріспе

РНҚ бар вирустарды қоспағанда, барлық тірі организмдердің генетикалық бағдарламасы ДНҚ нуклеотидтер тізбегінде жазылады. Сондықтан организмнің бірегей қасиеттерін сақтау үшін әрбір келесі буында бұл тізбекті дәл жаңғырту қажет. E. coli, мысалы, аз немесе мүлде қатесіз көшірілуі керек. толық геномәрбір келесі буынның түзілуінде 4 · 10 6 нуклеотид жұбының мөлшері; сол сияқты, 23 жұп хромосомадағы 4 × 10 9 негізгі жұп дерлік әрбір жасушалық бөліну актісімен көшірілуі керек. ДНҚ -ның негізгі қасиеті - ол үлгі ретінде қызмет етеді және нуклеотидтердің жаңа полинуклеотидтік тізбектерге орналасу ретін анықтайды.

ДНҚ репликациясының өзі кең мағынада бөлінетін жасуша үшін өте маңызды процесс. Оған хроматинді репликацияға дайындау және қайталанған митоздың алдын алу кіреді. Бұл бір жасушалық цикл кезінде ДНҚ -ның бір қайталануын қамтамасыз етеді, осылайша геномның тұрақтылығын сақтайды.

Тірі организмдердің генетикалық тұрақтылығы көбінесе ДНҚ -ны репликациялайтын ақуыздар кешенінің жұмысымен анықталады. ДНҚ-ның репликациясы механизмі белгісіз болып қалатын ақуыз-белок пен ДНҚ-ақуызының әр түрлі әсерлесуімен реттелетіні анық. Сонымен қатар, ДНҚ репликациясы кешені ДНҚ зақымдалуын түзейтін ақуыздық кешендермен үйлесімді жұмыс жасайды. Сонымен қатар, ақпаратты ата -анадан қызға беру процесі тұқым қуалайтын әртүрлілікті жасау үшін ДНҚ молекулаларының рекомбинациясымен жүреді. ДНҚ -ның рекомбинациялану процесі жыныстық жасушалардың түзілу процесінде мейозды кросспен егжей -тегжейлі сипатталған, V (D) J -рекомбинациясымен - ДНҚ -ның кейбір жөндеуінің әсерінен иммуноглобулиндер мен иммуноглобулиндердің әр түрлі гендерінің түзілу процесі. жүйелер. ДНҚ метаболизмі процестерінің әртүрлілігі мен дәйектілігін ескере отырып, біз ұрпақтан -ұрпаққа тұқым қуалайтын материалдың тұрақты репродукциясын жүзеге асыратын ақуыз кешендерінің одан да көп түрлілігі мен күрделі өзара әрекеттесуін болжай аламыз.

ДНҚ өзінің екі еселену механизмі туралы ақпаратты кодтайтынын түсіну маңызды: кейбір гендер ДНҚ нуклеотидінің прекурсорларын синтездейтін ферменттерді кодтайды, басқалары - белсендірілген нуклеотидтерді полинуклеотидтік тізбектерге жинайтын ақуыздар. Репликация процесін басқа жасушалық оқиғалармен үйлестіретін гендер, сонымен қатар ДНҚ -ны хроматинге орайтын белоктарды кодтайтын гендер бар.

Бұл жүйелердің реттелуі мен динамикасын түсіну XXI ғасырдың молекулалық биологиясының негізгі мәселесі болып табылады.

1 тарау. Репликация - полимеразды реакция

1953 жылы ДНҚ құрылымының моделін ашқанда, Джеймс Уотсон мен Фрэнсис Крик былай деп жазды: «Біз жариялаған нақты базалық жұптастыру теистикалық материалды көшірудің қандай да бір механизмін білдіретінін түсінбей қоймадық». Олар бірінші болып байқады: «Егер сіз тізбектердің біріндегі негіздердің нақты тәртібін білсеңіз, екіншісіндегі негіздердің орналасу тәртібін жаза аласыз, себебі базалық жұптасу нақты. Осылайша, бір тізбек екіншісін толықтырады; дәл осы қасиет ДНҚ -ның өзін қайталай алатынын көрсетеді ».

Уотсон мен Крик ДНҚ -ның қосарлануы үшін спиральды дуплексті ұстайтын сутегі байланыстары үзіліп, жіптер бөлінуі керек деген болжам жасады. Олар сондай -ақ дуплекстің әрбір тізбегі комплементарлы тізбектің синтезі үшін матрица қызметін атқарады және нәтижесінде екі жұп тізбек түзіледі, олардың әрқайсысында тек біреуі ата -анасы болады деп ұсынды. Бұл ДНҚ қос спиральындағы нуклеотидтер жұбының реттілігін дәл жаңғырту механизмі. Уотсон мен Крик ДНҚ репликациясы ферменттердің қатысуынсыз өздігінен жүреді деп есептеді, бірақ бұл дұрыс емес болып шықты. Дегенмен, ДНҚ -ның қайталануы спиральдың әр тізбегі берген комплементарлық ережеге сәйкес нуклеотидтердің дәйекті түрде қосылуы арқылы пайда болады деген пікір гендердің нақты көбеюінің тұжырымдамалық мәселесін шешті.

Жалпы қабылданған модельге сәйкес, барлық екі тізбекті ДНҚ репликациясы жартылай консервіленген. Табиғатта екі тізбекті ДНҚ репликациясының альтернативті әдістерінің бар-жоғы белгісіз. Осылайша, әрбір репликация оқиғасынан кейін екі қыз молекуласының бір тізбегі ата -аналық, консервативті, ал екіншісі жаңадан синтезделген, қызы. Дәл осы көшіру механизмі жартылай консервативті деп аталады. Егер геном бір жіпшелі ДНҚ-мен (кейбір вирустардағыдай) ұсынылса, онда бұл бір тізбек қосарланған тізбектің пайда болу матрицасы ретінде қызмет етеді, содан кейін қыз дуплекстері немесе бір тізбекті көшірмелері матрицалық тізбектердің бірі осы дуплексте синтезделеді.

Уотсон мен Крик 1953 жылы екінші жұмысында мұрагерлік материалды көшірудің мүмкін механизмін ұсынды. ДНҚ молекуласының тізбектері бөлініп, олардың әрқайсысы жаңа комплементарлы тізбек синтезделетін матрицаға айналатынын елестету оңай. Нәтижесінде ата-аналық молекуладан айырмашылығы жоқ екі қызды екі тізбекті ДНҚ молекуласы түзіледі.

1957 жылы А.Корнберг бактериялардан ашты E. coliнуклеотидтерден ДНҚ полимерлену процесін катализдейтін фермент - ДНҚ полимераза 1. 1959 жылы А.Корнберг ДНҚ биосинтезінің механизмін ашқаны үшін Нобель сыйлығымен марапатталды. Ол ДНҚ молекулаларының қайталануы қарапайым биохимиялық реакцияларға негізделгенін көрсетті.

Жалпы алғанда, 5 «-деоксинуклеотидтер тобын праймер тізбегінің соңғы нуклеотидінің 3» -OH тобына бекіту реакциясын келесі түрде ұсынуға болады:

N + dNTP<->n + 1 + PP i

мұндағы dNMP - төрт ортақ нуклеотидтердің кез келгені. Репликацияның бір әрекетінде 3'-ұшы бар жіп бір нуклеотид қалдықтарымен ұзарады, ал пирофосфат жойылады. Нуклеотидті қосу реакциясы қайтымды, бірақ жасушадағы бейорганикалық фосфат тез бұзылатындықтан, реакция синтезге белсенді түрде бағытталады. ДНҚ репликациясы әрқашан ДНҚ тізбегінің 5'-ұшынан (яғни құрамында 5'-дезоксинуклеотид тобы бар) 3'-ұшына дейін (құрамында бос 3-ОН тобы бар) жүреді және бұрын синтезделген болуын талап етеді. ДНҚ тізбегінің фрагменті реакция полимеризациясының праймері ретінде. Бос 3 'ұшы бар мұндай ДНҚ фрагменті праймер деп аталады. Праймерге тәуелді, ДНҚ үлгісімен анықталатын дезоксинуклеотидті қосу реакциясын катализдейтін ферменттер ДНҚ полимеразалары деп аталады. Бүгінгі таңда ДНҚ полимеразаларының бірнеше түрлі сыныптары оқшауланған және сипатталған, бұл ферменттердің қасиеттері мен олар катализдейтін реакциялар егжей -тегжейлі сипатталған. Біз олардың құрылымы мен жеке ерекшеліктері туралы келесі тарауларда егжей -тегжейлі айтатын боламыз.

1.1. Репликациялық шанышқы

Репликация процесі репликациялық шанышқылар деп аталатын арнайы құрылымдарда жүреді. Coli репликативті шанышқының схемасы күріште көрсетілген. 1. ДНҚ молекуласының екі тізбегінің бір -біріне параллель орналасуы олардың бір мезгілде көп бағытты репликациялануына бірқатар мәселелер туғызады.

Шанышқы қозғалатын кезде екі қыз тізбегін бір уақытта синтездеу керек. Шанышқы 5 -тен бағытта қозғалады " бір тізбекте 3 '-ке дейін және 3 -тен ’ 5 «дейін- екінші жағынан. Алайда нуклеин қышқылдарытек 5 «- 3» соңына дейін синтезделеді. Есеп шешуші ағындардың бірінде 5 «-3» бағытта үздіксіз синтезделетін етіп шешіледі, бұл репликациялық айырдың қозғалысына сәйкес келеді. Бұл жетекші немесе жетекші деп аталады. Басқа жіп артта қалу немесе артта қалу деп аталады, өйткені ондағы синтез жетекші жіппен салыстырғанда белгілі бір кідіріспен жүреді. Бұл осы жіптегі ДНҚ 5 -тен 3 -ке дейін, бірақ шанышқының қозғалысына қарама -қарсы бағытта және қысқа үзінділерде синтезделуіне байланысты. Осының арқасында ДНҚ -ның көп бағытты синтезін бір құрылымның ішінде - репликативті шанышқының ішінде жүргізуге болады.

Күріш. 1. Репликативті шанышқының схемасы.

Прокариоттарда мұндай қысқа фрагменттердің ұзындығы 1000–2000 а.к. Оларды ашқан ғалымның атымен олар «Оказаки фрагменттері» деп аталды. Репликативті шанышқының қозғалысы кезінде көршілес Оказаки фрагменттерінің ұштары қосылып, үздіксіз артта қалатын жіп құрайды. Процесс екі тізбекте де синхронды түрде жүруі үшін жетекші және артта қалатын тізбектердің полимеразалық комплекстері өзара үш өлшемді күрделі құрылымды құрады (1-сурет, б).

Репликациялық шанышқы репликацияның шыққан жерінен бір бағытта немесе екі бағытта қозғалуы мүмкін. Осыған байланысты процесс бір бағытты немесе екі бағытты репликация деп аталады. Схемалық түрде қалай көрінеді, суретте көрсетілген. 2. Эукариоттарда репликация әдетте екі бағытты болады. Сонымен қатар E.coli.

Репликацияның басталуында және артта қалатын тізбектегі Оказаки фрагменттерінің пайда болуында репликацияны бастау механизмдері принцип бойынша ұқсас, бірақ кейбір айырмашылықтар бар. Екі жағдайда да қысқа РНҚ тұқымдары түзіледі. (праймерлер ), үлгісі ДНҚ -ны толықтырады, оның жалғасы түрінде жаңа ДНҚ тізбегі синтезделеді. Кейіннен қысқа РНҚ кірістірулері ДНҚ сегменттерімен алмастырылады, содан кейін жеке Оказаки фрагменттері біріктіріліп үздіксіз артта қалу тізбегін құрайды.

Жердегі барлық тірі организмдер әдетте прокариоттар мен эукариоттарға бөлінеді (грекше карион - ядро). Прокариоттардың басты ерекшелігі-эукариоттардан айырмашылығы, мембранамен қапталған жасушаның толыққанды ядросының болмауы. Прокариоттардың генетикалық материалы нуклеоидта орналасқан - эукариоттық ядроның қарабайыр эквиваленті. Прокариотты жасушалар өте кішкентай - шамамен 1 микрон. Эукариот жасушаларының көлемі прокариот жасушаларының көлемінен 800-1000 есе үлкен. Прокариоттарға бактериялар мен археялар (немесе археялар) жатады, олардың ата -бабалары шамамен 4 миллиард жыл бұрын пайда болған. Эукариоттар біржасушалы да, көпжасушалы да болуы мүмкін. Олар Жерде прокариоттардан шамамен 500 миллион жыл өткен соң пайда болды.

Қазіргі түсініктерге сәйкес прокариоттардағы ДНҚ метаболизмінің эукариоттардан айырмашылығы бар. Репликация мен рекомбинация процестерін сипаттағанда, біз бұл айырмашылықтарды әр кезде атап өтеміз.

2 -тарау. Репликацияны бастау

ДНҚ репликациясы молекуланың кез келген кездейсоқ нүктесінен басталмайды, бірақ репликацияның шығу тегі немесе олригин деп аталатын белгілі бір жерлерде басталады. Көшіру процесі ДНҚ толық қайталанғанға дейін бір немесе екі бағытта репликативті шанышқыларды қалыптастыру арқылы жалғасады. Жабық дөңгелек ДНҚ молекулаларында жаңадан синтезделген тізбектер репликативті шанышқылардың жиналу нүктелерінде немесе бір шанышқының репликацияның басталуына оралатын жерінде ковалентті түрде қосылады. Қыздардың молекулалары, әдетте, репликацияның жаңа раунды басталмай тұрып -ақ бөлінеді.

SV40 вирусының (5,2 кб) геномы сияқты әр түрлі мөлшердегі геномдар, бактериофаг? (48,5 tpn) және E. coli (4-10 3 tpn) белгілі бір нүктеде болатын бір басталатын оқиғаның нәтижесінде шығарылады.

Күріш. 2. Репликативті шанышқының мүмкін болатын қозғалысы.

Про- және эукариоттарда сіз осы тақырып бойынша әр түрлі вариацияларды таба аласыз. Осылайша, жануарлардың митохондриялық ДНҚ (15 кб) ата -аналық спиралінің әрбір тізбегінің репликацияның өзіндік шығу нүктесі болады. Кішкентай бір тізбекті фаг геномдарының комплементарлы тізбегінің синтезі белгілі бір реттілікке жақын басталады, ал алынған дуплекстің репликациясы мүлде басқа нүктеде басталуы мүмкін. Сызықты қос тізбекті ДНҚ-ның репликациясы белгілі бір жерлерде де басталады. Мысалы, бактериофаг T7 ДНҚ (40 кб) бір нүктеден бастап молекуланың әр түрлі ұштарына қарама -қарсы екі бағытта репликацияланады, ал адам аденовирустың екі ДНҚ тізбегінің әрқайсысы (30–38 кб) әрқашанда дәйекті түрде қайталанады. 3 «соңы.

Эукариотты жасушалардың геномдары хромосома бойымен шамамен 20 кб қашықтықта шашыраған репликацияның көптеген шығу нүктелерінің болуымен сипатталады. Басталғаннан кейін репликация әр нүктеден екі бағытта жалғасады және екі іргелес репликацияның бастапқы нүктелерінің шанышқылары қосылғанша жалғасады. Әрбір қыз хромосомасының толық ұзындықтағы ДНҚ-сы қысқа, дербес басталған жаңадан синтезделген жіптерді қосу арқылы алынады.

2.1. Репликон және репликацияның пайда болуы туралы түсінік

Жетекші тізбектің жеке фрагменті синтезделетін ДНҚ бөлімі репликон деп аталады. Көптеген прокариоттарда олардың геномында репликация инициациясының бір ғана нүктесі болады, яғни олардың ДНҚ -да бір ғана репликоны болады. Эукариоттық геномдар - полирепликон.

Репликация басталатын репликонның шығу тегі репликацияның шығу тегі деп аталады. Бұл ақуыздың арнайы кешендерімен танылатын шығу тегі және репликациялық шанышқының қалыптасуы одан басталады.

Кейбір жағдайларда репликацияның шығу тегі нуклеотидтер тізбегіне ие, дуплекс инициацияға қатысатын белоктар мойындайтын ерекше конфигурацияны алады. Репликацияның шығу нүктесі мен ақуыздардың өзара әрекеттесу сипаты мен жалпы инициация механизмі жеткілікті түрде зерттелмеген, алайда, әр түрлі жағдайда олар әр түрлі болады деп айта аламыз.

2.2. E.coIi oriC репликациясының шығу тегі

E. coli мен Bacillus subtilis шығу тегі толық зерттелген. Хромосомалардың репликациясының пайда болу аймағы oriC (хромосоманың шығу тегі) өзіне белгілі бір тізбегі бар аймақтарды, ДНҚ қорапшалары деп аталады және олардың арасында орналасқан қысқа тізбектерді қамтиды. Нуклеотидтердің белгілі бір «мотиві» бар ДНҚ қораптары, негізінен 9bp-де, құрамында АТ көп болатын 12-1Zbn фрагменттерімен қиылысады. Тоғыз мүшелі тізбектердің өзі бір-біріне қатысты түзу және төңкерілген күйде орналасуы мүмкін. Мысалы, B. subtilis бір TTATSSACA фрагменті мен басқа екі тоғыз мүшелі, қарама-қарсы бағытталған, базалық жұптардың бірін алмастырумен. Жалпы алғанда, B. subtilis -те C -де 15 ДНҚ қорапшасы бар. OriC аймағы өте консервативті: ұқсас құрамдағы ДНҚ қорапшалары басқа бактериялардағы хромосоманың сәйкес орнында болады (тек Mycoplasma genitalium -да, барлық бактерияларға ортақ репликация ферменттерінің болуына қарамастан, ДНҚ қораптары табылған жоқ). ДНҚ қорапшалары ақуызды немесе РНҚ -ны кодтамайды, бірақ олардың арасында бөлек гендер орналасқан. Бұл гендердің өнімдері де ДНҚ репликациясы процесінің «сақталуына» көп қатысады.

ДНҚ қораптарының орналасу тәртібі, аралық аймақтар және олардың саны oriC -тің эволюциялық алшақтығы негізінен қайталау мен үш еселенуге байланысты болғанын көрсетеді. Прокариоттардың абстрактілі «минималды шығу тегі» диаграммасы күріште көрсетілген. 3.

Күріш. 3.Прокариоттардың пайда болуының минимумын ұйымдастыру

Прокариоттардың минималды шығу схемасы.

2.3. Басқа организмдердің шығу тегі

SV40 вирусының репликациясының шығуының негізгі бөлігі ДНҚ-ны ажырататын ақуызды (DUE) байланыстыратын арнайы ақуыз Т антигенін (T-ag) байланыстыру үшін қажет шығу тегін тану элементінен (ORE) тұрады. ), және AT нуклеотидтермен байытылған элемент. Репликация шанышқысы қарама -қарсы бағытта қозғала бастаған бөлік бастапқы екі бағытты репликация (OBR) деп аталады.

Көмекші элементтер (Aux) T антиген димерлерін (Aux-1) және Sp1 транскрипция коэффициентін (Aux-2) байланыстырады. Бұл элементтер арасындағы қашықтық және олардың бағытталуы репликацияны бастау процесінде маңызды рөл атқарады. SV40 вирусының шығу схемасы суретте көрсетілген. 4.

Эукариоттарда репликацияның шығу тегінің гомологтары 1980 жылы Р.Дэвис пен Дж.Карбон ашқан автономды репликацияланатын тізбектер немесе ARS болып табылады.

Күріш. 4. SV40 вирусының шығу диаграммасы.

Saccharomyces cerevisiae ашытқысында ашытқы жасушасындағы ДНҚ фрагменттерінің репликациясын қамтамасыз етуге қабілетті арнайы тізбектер басқа эукариоттарға қарағанда ертерек оқшауланған. Кейінірек мұндай тізбектер басқа да көптеген организмдерде кездесті. S. cerevisiae-де ARS 100-200 а.к. құрайды және консенсустың белгілі бір реттілігін (ACS-ARS консенсус реті) қамтиды, көлемі 11 bp, инициатор ақуызымен байланысу үшін қажет, сонымен қатар күшейтетін қосымша элементтер (B-элементтері) шығу функциясы. Мысалы, ARS1 - бірінші мұқият сипатталған шығу тегі - осындай үш элементтен тұрады - B1, B2, VZ. ACS және B1 тізбектері шамамен 50 а.к. құрайды және инициатор ақуызымен байланысу үшін қажет кез келген шығу тегі ең кіші функционалды аймақты білдіреді.

B2 элементінде әдетте генетикалық сипатталған DUE аймағы бар. В3 қосымша элементі Abf-1 транскрипция коэффициентін байланыстырады. ARS элементінің жалпы ұзындығы 100-200 а.к. S. cerevisiae шығу тегі құрылымы суретте көрсетілген. 5.

Күріш. 5. Saccharomyces cereiseae шығу тегі схемасы

Басқа ашытқыда, Shizosaccharomyces pombe, шығу тегі кем дегенде бір ARS -ден тұрады, бұл S. cerevisiae -ге қарағанда едәуір ұзағырақ. Кейбір жағдайларда бірнеше ARS элементтері репликацияны бастау аймағын құрайды. (Cурет 6.)

Күріш. 6. Shizosaccharomyces pombe шығу схемасы

Сүтқоректілерде шығу тегі егжей -тегжейлі сипатталмайды; олардың кейбіреулері генетикалық интервалдарда орналасқан, транскрипция факторлары үшін байланыстыратын орындары бар және көбінесе екі жақты репликацияның басталу аймақтарын ғана қамтиды - ОБР.

2.4. Репликация жылдамдығы

Геномның репликациялану жылдамдығы негізінен оқиғалардың басталу жиілігімен реттеледі. Осылайша, E. coli -де әр репликативті шанышқының көшіру жылдамдығы тұрақты және секундына шамамен 1500 а / с тең: сондықтан 4 × 10 6 bp толық геномы шамамен 40 мин ішінде қайталанады. Егер хромосома тезірек репликацияланатын болса, бұл инициация жиілігі сол көшіру жылдамдығында репликацияның бастапқы нүктесінде әрекет ететінін білдіреді. E. coli жасушалары әр 20 минут сайын бөлінеді; Бұл ДНҚ репликациясының репликацияның алдыңғы кезеңін әлі аяқтамаған хромосомаларда басталатынын білдіреді. Эукариот жасушаларындағы репликативті шанышқының қозғалу жылдамдығы әлдеқайда төмен (секундына 10-100 соққы), бірақ хромосомалардың репликациясының ақылға қонымды уақыт ішінде аяқталуы бір мезгілде бірнеше нүктеде инициацияланумен қамтамасыз етіледі. Сонымен, хромосомалардың репликациялану жылдамдығы репликацияның шығу саны мен орналасуымен бақыланады. Мысалы, ерте дрозофила эмбрионында бір хромосоманың репликациясы әр 3 минут сайын болады, бұл оқиғалардың бір уақытта 7000-8000 а.к. нүктелерінде дерлік басталуына байланысты. Бұл ретте Дрозофилада эмбрионалдылықтың ерте даму кезеңінде репликация жылдамдығы да, репликондардың мөлшері мен саны да тіндерге тән екені белгілі. Сол дрозофиланың соматикалық жасушаларының культурасында хромосомалардың екі еселену жылдамдығы әлдеқайда баяу, себебі репликация 40 000 а.к. қашықтықта орналасқан нүктелердің әлдеқайда аз санынан басталады, ал S фазасының ұзақтығы 600 мин. Демек, ДНҚ синтезінің белгіленген жылдамдығында бірнеше инициация тұтастай репликация процесінің жылдамдығын арттырады және осылайша хромосомалардың барлық жиынтығын қайталауға кететін уақытты қысқартады. Репликация саны мен репликация жылдамдығы туралы мәліметтер 1 -кестеде көрсетілген.

S-фазаның ұзақтығының айырмашылығы басқа организмдерде де анықталды. Мысалы, Ньютте S фазасы бластуланың ядроларында 1 сағатқа, сперматоциттердің премиотикалық S фазасында 200 сағатқа созылады. Мүмкін, S-фазаның ұзақтығы ДНҚ синтезінің жылдамдығымен емес, репликацияның шығу тегінің санымен анықталады. Жаңа нейрула жасушаларының ДНҚ -сында олар бір -бірінен шамамен 40 мкм қашықтықта, ал соматикалық жасушаларда - 100 микронға жуық орналасқан.

Кесте 1

Әр түрлі организмдердегі репликондардың саны мен ұзындығы.

Қазіргі түсініктерге сәйкес эукариоттардағы репликондар геномда кездейсоқ таралмайды, олар топтарда орналасады (репликон ошақтары). Бұл топтарда немесе ошақтарда репликациялық ферменттер жиналады, олар бір уақытта ұзындығы шамамен 100 кб болатын 10-100 көршілес репликондардың репликациялық шанышқыларын ұзартады. Олардағы репликация 45-60 минутта аяқталады. Сонымен қатар, өте ұзақ репликондар бар (1000 tpn астам) - соншалықты үлкен, оларда репликация бірнеше сағатты алады.

Репликацияның шығу тегі барлық S-фазада белсендіріледі. Мысалы, S. cerevisiae ARS1 ерте S фазасында, ал ARS501 кеш S фазасында қосылады. Көптеген шығу тегі S-фазаның ортасында іске қосылады. S. cerevisiae хромосомаларының ерте немесе кеш фазасында репликацияланатын бөлімдері мозаикалық, яғни олар араласып кеткені қызықты. S. cerevisiae -де IV хромосоманың орталық аймағы ерте S фазасында, ал теломерлер соңғы S фазасында қайталанатыны анықталды. 67 хб ДНҚ аймағы, V хромосомасының оң жағындағы теломераға іргелес және құрамында ARS501 бар, S фазасының соңында қайталанады. Шамасы, хромосоманың бұл аймағының кеш репликациясы оның теломераға жақындығының салдары болып табылады. Сонымен қатар, S фазасының соңында «үнсіз» гендердің репликацияланатыны белгілі, мысалы, субтеломерлік аймақтарда локализацияланған жасушалардың белгілі бір түрлерінде көрсетілмеген HML және HMR локустары. Керісінше, белсенді экспрессияланған гендер, мысалы, MAT локусы, S фазасының бірінші жартысында қайталанады.

3 -тарау. Репликацияны бастау

Репликацияның шығу тегі - репликация шанышқысы өз қозғалысын бастайтын жер. Бірақ ДНҚ полимеразалары басқа ақуыздардың көмегінсіз репликация процесін бастай алмайды. Приназаның шығу тегін тануға және тартуға қатысатын ақуыздар - ДНҚ синтезі үшін «тұқым» праймерін синтездейтін РНҚ -полимераза мен ДНҚ полимеразасы репликацияның инициалды кешенін құрайды.

3.1 E. coli -де репликацияның басталуы

In vitro жүйесіндегі орикальды репликацияның басталуы алты белокты қамтитын комплексті құрудан басталады: DnaA, DnaB, DnaC, HU, Girase және SSB. Біріншіден, DnaA мономері тоғыз мүшелі тізбекпен байланысады, содан кейін бұл ақуыздың 20-40 мономері үлкен агрегат құрайды. Бастапқы ДНҚ оны қоршап алады, ал ДНҚ тізбектері үш он үш мүшелі үш тізбекте бөлінеді. Келесі кезеңде DnaB / DnaC димері oriC / DnaA комплексіне қосылып, радиусы 6 нм сфераға сәйкес келетін шамамен 480 кДа агрегатты құрайды. Нәтижесінде репликациялық шанышқы пайда болады.

3.2. Эукариоттарда репликацияның басталуы

Эукариотты ДНҚ репликациясының басталуы репликацияның шығуының комплексін және репликацияның инициаторлы ақуызын құрудан басталады. Бұл комплекс пост-репликативті (өсу-RC) деп аталады. Ол көп құрылымдарды жинауға арналған платформа ретінде қызмет етеді жоғары тәртіпхроматинді репликацияға жарамды күйге аударады. Репликация инициативті кешендерінің қалыптасуының кезекті кезеңдері күріште көрсетілген. 7.

S. cerevisiae -де алғаш рет сипатталған шығу тегін тану кешені (ORC) эукариот жасушаларында ДНҚ репликациясының бастамашысы болып табылады. Кейіннен ОРК тәрізді ақуыздар эукариоттардың басқа өкілдерінде, сондай-ақ сүтқоректілер мен адамдарда ашылды және зерттелді. Барлық эукариоттарда ОРК алты суббірлікпен түзіледі-Ogc1-Ogsb (120-50 кДа). Кешеннің барлық алты бөлімшесі S. cerevisiae өмірлік белсенділігі үшін өте қажет. ORC қосалқы бірліктерінің екі түрлі тобы репликацияның шығу тегімен байланысқан кезде шығу тізбегін тануға қатысады. Orc1, Orc2 және Orc4 ACS-пен өзара әрекеттеседі, қалған үш бөлімше B1 тәрізді элементтерді таниды. Мүмкін, В1 нуклеотидтер тізбегімен байланыс тек Orc5 арқылы жүзеге асады. ОРК ДНҚ -мен АТФ болған жағдайда ғана байланысады және АТФазалық белсенділігі бар, ол ақуыздың АТФ және АРС элементтерімен үйлесімді әрекеттесуімен реттеледі. ATP Orc1 қосалқы бірлігімен байланысады және ORC -ті бастапқыға бекіту үшін қажетті кофактор рөлін атқарады. ORC-мен байланысқан шығу тегі нақты бірізділік Orc1 ATPase белсенділігін тежейді, ал S фазада пайда болатын бір тізбекті ДНҚ аймақтары оны қайта жандандырады. Сонымен қатар, ОРС конформациясы өзгереді - кеңейтілгенден (ұзартылғаннан) қисыққа (бен). Мүмкін, Orc1 қосалқы бөлігінің АТФ байланыстыруы мен гидролизі жасушалық циклдегі ОРК функцияларын басқаруға қатысады.

Бөлгіш ашытқыда S. motbe, Ohc4 ақуызы N терминалы доменінде «AT ілгектері» деп аталады, олардың көмегімен ОРК AT тізбегіне бай ARS1 бірнеше аймақтарымен байланысады. S. cerevisiae-де ОРС митоздың соңында шығу тегіне жабысып, пост-репликативті кешенді (пост-РК) құрады және кейінгі жасушалық циклдарда онымен байланысты болып қалады. Бұл жағдайда пост-RC S, G2 және M фазаларында болады, ал G1 фазасында ол репликативті кешеннің (pge-RC) бөлігі болып табылады.

Пререпликативті кешен пост-РК негізінде құрылады, бұл процесс барлық шығу тегіде бір мезгілде M және G1 фазаларының шекарасынан басталады және S-ге ауысқанда бірінші активтенетін бастапқыда G1 соңында аяқталады. фаза Кейін S-фазада белсендірілетін шығу тегі бойынша, pge-RC түзілуі олардың әрқайсысы үшін S фазасының сәйкес кезеңінде аяқталады. G1 фазасында, pge-RC құрастыру кезінде ORC циклинге тәуелді киназалармен әрекеттесе алады (Cdks, циклинге тәуелді киназалар). Бұл өзара әрекеттесу-бұл жасушаға митоздан кейін алдын ала РК түзуге мүмкіндік беретін механизмдердің бірі. M / G1 фазалық шекарасында пост-RC-ге бірінші болып жасушалардың бөліну циклінің ақуызы (Cdc6) және алты ақуыздан тұратын минихромосомалық қызмет көрсететін ақуыздар (Mst 2-7) кіреді. Mst 2-7 протеиндері алғаш рет анықталған «мини-хромосомалық тірек» ақуыздарының отбасында ең танымал болып табылады. S. сerevisiaeмини-хромосомалардың тұрақтылығын сақтауға қабілетсіз мутанттарды зерттеуде.

Күріш. 7. Эукариоттарда репликация инициациясының схемасы

Cdc6 және Mst 2-7 ақуыздары эукариоттардың көптеген өкілдерінде, соның ішінде сүтқоректілерде сипатталған. Жақында жасушаларда болатыны көрсетілді S.rotbeжәне жоғары эукариоттар, басқа ақуыз, Cdt1 (жасушаның бөлінуін тоқтату), prge-RC түзілуінің бастапқы кезеңіне қатысады. Mst 2-7 ақуыздары pge-RC негізгі компоненті гексамериялық MSM кешенін құрайды. MSM G1 фазасында ерте митозды тежеу үшін репликацияланбаған хроматинге бақылау сигналын шығарады. Сонымен қатар, жасушаны цикл арқылы S фазасына ауыстыру қажет. МСМ-нің репликацияның шығу тегіне қосылуы осы кешеннің жеке бөлімшелерінің фосфорлану-фосфорлануымен реттеледі. Мысалы, М фазасында гиперфосфорланған Мст4 қосалқы бөлігінің фосфорлануы жартылай РК түзілуіне ықпал етеді, ал Мст3 қосалқы бірлігінің толық дефосфорлануы кешенді инактивациялайды және оның хроматинмен байланысын болдырмайды. Сонымен қатар, МСМ -нің шығу тегіне қосылуы хроматинге МСМ -ны бірлесіп «отырғызатын» Cdc6 және Cdt1 ақуыздарына байланысты. Cdc6 жасушалары болмаған жағдайда S.cerevisiaeДНҚ репликациясын бастау қабілетін жоғалтады және «кесілген» митозға ұшырайды және репликацияланбаған хромосомалар шпиндельдік полюстерге кездейсоқ бөлінеді.

Cdc6 -ның ДНҚ репликациясы аяқталғанға дейін «кесілген» митоздың алдын алу қабілеті оның Cdks -пен әрекеттесуімен қамтамасыз етіледі. G1 фазасындағы Cdc6 белсенділігі оның АТФ-пен әрекеттесуімен де реттеледі, өйткені Cdc6 ATP байланыстырушы мотивінің сақталған тізбегіндегі мутациялар хроматиннің жасушаларда MSM байланыстыру қабілетінің жоғалуына әкелді. S.cerevisiaeжәне адам жасушаларында ДНҚ репликациясын басу. Бар S.cerevisiaeБасқа ақуыз, Mcm10, хроматинмен байланысты және Mst2-7 компоненттерімен өзара әрекеттесетін MSM-ді pge-RC-ке бекітуге қатысады. МСМ-нің шығу тегіне қосылуын осындай күрделі бақылау жасушада репликацияланбаған хроматин болған кезде қайталанатын митоздың алдын алу үшін қажет реттегіш механизмдердің көп сатылы жүйесі бар екенін көрсетеді. MSM-дің репликацияның пайда болуымен байланысы геномның тұрақтылығын қамтамасыз ету үшін қажет; бұл хроматинді репликация-лисцензия деп аталатын күйге көшіреді. Кеенопуста MCM байланыстыру үшін RLF-B аттас қосымша фактор қажет (герликацияны лицензиялау факторы В). MCM ақуыздары ДНҚ үшін емес, гистондарға жақындығын көрсетеді, нәтижесінде G1 фазасының соңында барлық препепликативті кешен репликацияның шыққан жерінде немесе оның жанында хроматинмен тығыз байланысады.

G1 фазасында, Cdc7 киназасы Dbf4 реттеуші суббірлігімен (ДНҚ байланыстырушы фактор 4) ішінара түзілген рге RC, ал G1 фазасының соңында немесе G1 / S фазасының шекарасында Cdc45 ақуызы мен бір тізбекті байланысады. ДНҚ байланыстыратын репликативті ақуыз А (RPA, репликациялық ақуыз А). G1 фазасының соңғы кезеңінде Cdc45 пен Dbf4 / Cdc7 арасындағы өзара әрекеттесу pge-RC құрастырылғаннан кейін шығу тегі бойынша репликацияның «активтенуі» үшін қажет.

Kinase Dbf4 / Cdc7 өз функцияларын орындай бастағанға дейін біраз уақытқа ори байланысады. Pge-RC-ге қосылғаннан кейін Dbf4 / Cdc7 киназасы Cdk активтендірілгенін «күтеді», содан кейін ғана оның астарын фосфорлайды. Бұл киназаның ориге ертерек байланысуының рөлі түсініксіз.

Cdc45 хроматинмен байланысуы Cdc6 және Mst2 ақуыздарына және Dbf4 / Cdc7 киназасы мен S фазасының циклинге тәуелді киназаларының белсенділігіне байланысты (Cdk-S-фаза-Cdc28 / Ckb5.6 ашытқы мен Cdk2 / Cuslins) A, E жоғары эукариоттарда). Cdc45 ақуызын Dbf4 / Cdc7 киназасы фосфорласа алады, бірақ бұл тек Cdk-S фазасы белсендірілгеннен кейін болады. Cdk-S белсенділігі, өз кезегінде, G1 фазасының соңында убиквитинге тәуелді протеолизден өтетін Sic1 ингибиторымен реттеледі. Cdc45 ақуызының pge-RC-ге қосылуы жасуша циклінің G1-фазасының соңында, тек S-фазасына өту кезінде ДНҚ синтезін бастайтын репликондардың шығу тегі кезінде болады. Cdk-S және Dbf4 / Cdc7-ге тәуелді Cdc45-тің басқа шығу тегіне байланысы олардың әрқайсысы үшін S-фазасы бойынша белгілі бір уақытта болады. Cdc45-ті prge-RC-ке бекітудің ықтимал механизмі келесідей: S фазасының сол кезеңінде әрбір шығу тегі Cdk-S фосфорилаттарының Mst2 әсерінен кейін G1 фазасындағы репликацияның барлық шығу тегі байланыстыратын Dbf4 / Cdc7. , ол әрбір шығу тегі үшін жеке анықталады. Mst2 фосфорлануының нәтижесінде MCM комплексінің конформациясы Cdc45 байланыстыру қабілетіне ие болатындай өзгереді. Бұл кезде RPA ақуызы pge-RC-ге бекітіледі. Cdc45 сияқты, RRA Cdk-S шығуымен Mst2 қатысуымен тәуелді түрде байланысады. Cdc45 және RPA протеиндерінің бекітілуі алдын ала РК жинауды аяқтайды. Рге-РК құрастыру аяқталғаннан кейін бірден оның жартылай диссоциациясы пайда болады, бұл РК (репликациялық кешен) түзілуінің басталуымен бірге жүреді. Cdc6 ақуызы G1-ден S фазасына немесе одан да ертерек өту кезінде pge-RC-ден бірінші болып диссоциацияланады, Cdks фосфорлануынан өтеді, содан кейін барлық жерде және деградацияға ұшырайды. Cdc6 инактивациясының бұл жолы төменгі эукариоттар үшін де, жоғары эукариоттардың кейбір өкілдері үшін де көрсетілген. Адам жасушаларында Cdc6 деңгейі жасушаның бүкіл циклінде тұрақты болып қалады. Бірақ S фазасына өту кезінде Cdc6 ядродан цитоплазмаға тасымалданады. Шамасы, бұл процесс Сdks арқылы реттеледі. Ядродан Cdc6p жою (гидролиз немесе цитоплазмаға тасымалдау арқылы) - бір жасушалық циклде бірнеше репликацияның алдын алатын механизмдердің бірі.

Cdt1 ақуызы pge-RC түзілуі аяқталғаннан кейін де инактивацияланады. Сонымен қатар, төменгі эукариоттардың жасушаларында Cdt1. ол мезгіл -мезгіл өрнектеледі, G1 фазасында ядроларда жиналады, ал G2 фазасында оның деңгейі төмендейді. Жоғары эукариоттарда Cdt1 белсенділігі G1 фазасында жасушаларда жоқ, S, G2 және ішінара М фазаларында жинақталатын және метафаза мен анафаза шекарасында М фазасында жоғалып кететін геминин протеинінің ингибиторларымен бақыланады.

Cdc6 мен Cdt1-ден айырмашылығы, Mst2-7, RPA және Cdc45 ақуыздары, prge-RC-ден диссоциацияланып, ДНҚ синтезі кезінде S-фазада хроматинмен байланысады. Ашытқы жасушаларындағы rte-RC-ден MSM-нің тез шығуы Mcm10 мен Mst7 арасындағы өзара әрекеттесу арқылы қамтамасыз етіледі. MSM мен Mst10 бөлінуін Cdc45 ақуызы жеңілдетеді.

MSM кешенінің Mst4,6,7 қосалқы бірліктері гликаза белсенділігін көрсетеді, ол тек Cdk-S және Dbf4 / Cdc7 киназамен стимуляция кезінде көрінеді. Mst2-7 ақуыздары тек инициация үшін ғана емес, сонымен қатар репликацияның созылу фазасы үшін де, репликативті шанышқылардың ілгерілеуі үшін де қажет. MSM RC құрамына кіреді және репликативті шанышқыларда екі тізбекті ДНҚ-ны босатуға қатысады. Адам жасушаларында РС түзілуі кезінде МСМ-нің шығу тегіне байланысы Mcm10-дан айырмашылығы S-фазада хроматинмен жинақталатын және түзетін Mcm10 ақуызының қатысуымен жүзеге асады. S. segeevisiae... Жасушалардың G2 -ден M фазасына ауысуы кезінде Mcm10 гиперфосфорланады және хроматиннен диссоциацияланады, ал M / G1 фазасының шекарасында протеосомалық механизммен протеолизден өтеді. Осылайша, адам жасушаларында Mcm10 фосфорлануы мен протеолизі ДНҚ репликациясы аяқталғаннан кейін МСМ белсенділігін төмендетеді. Сонымен қатар, МСМ белсенділігін теріс реттеу осы кешеннің жеке компоненттерінің тікелей фосфорлануынан туындауы мүмкін. Мысалы, M фазасындағы Cdk-спецификалық Mcm4 тораптарының фосфорлануы Mst4,6,7 геликаза активтілігінің жоғалуына және эмбриондық ядроларда Cdk-циклин Е кешенінің жоғары концентрациясына әкеледі. Гепорус Mst3 -тің ДНҚ -мен байланысуына кедергі келтіреді және осылайша репликация аяқталғаннан кейін MSM -нің хроматинмен қайта ассоциациялануына жол бермейді. MSM кешені жасушалардың G1 фазасына ауысуы кезінде репликация инициациясының бастапқы кезеңінде ғана емес, сонымен қатар S процесінде бұл процестің аяқталуына қатысады. функциялары: ол ДНҚ -ны шығарады және қалғандары бекітілген тірек қызметін атқарады. РС түзілуінің компоненттері. Сондықтан МСМ қызметін реттеудің көптеген механизмдері түсінікті. Егер G1 фазасында бұл механизмдер жасушалардың қайталанған митозсыз S фазасына өтуіне ықпал етуге бағытталған болса, онда S және G2 фазаларында олар репликацияланған хроматиннің қайталанған репликациясына жол бермейді.

RPA-бұл ДНҚ байланыстыратын бір тізбекті ақуыз және репликацияны бастау кезінде оның RC құрамында болуы ДНҚ-ның бөлінбеген аймағын тұрақтандыру үшін қажет. RPA 70, 34 және 11 кДа молекулалық салмағы бар үш бөлімнен тұрады, ал бір тізбекті ДНҚ байланыстыратын белсенділік 70 кДа суббірлікке жатады, ал 34 кДа суббірлік реттеуші болып табылады. Соңғысы ДНҚ репликациясын белсендіру үшін қажет болып табылатын Cdk фосфорилденген. Бұл кешеннің толық сипаттамасы төменде беріледі.

Cdc45 ақуызы да RC түзуге қатысады. ДНҚ -полимеразаны бекіту үшін қажет пе? репликацияның шығу тегі туралы. Адам Cdc45 ақуызы адамның Mst7 ақуызымен және ДНҚ полимеразасының р70 суббірлігімен байланысатыны көрсетілді? in vitro. Cdc45 ДНҚ полимеразасын қосады ма? Mst7 -ге байланыстыру арқылы RC -ге. Ашытқы жасушаларында S.cerevisiae Cdc45 ДНҚ полимеразасын қосады ма? хроматинге Mst2 қатысуымен.

ДНҚ репликациясын тудыратын кешеннің компоненттерінің бірі - ДНҚ полимераза β. Эукариоттардың көптеген ДНҚ полимеразаларының ішінен рибонуклеозид трифосфаттарынан праймер - қысқа РНҚ «праймерін» синтездеуге қабілетті примаза белсенділігін қамтиды. РНҚ праймері репликация триггерлерінің бірі болып табылатын сигнал шығарады. ДНҚ полимераза? барлық зерттелген эукариоттарда кездеседі және жақсы зерттелген. Бұл ферменттің толық сипаттамасы келесі бөлімде беріледі. Репликация инициациясын реттеу әдістерінің бірі ДНҚ полимеразасының екі үлкен суббірлігінің фосфорлануымен байланысты екендігі көрсетілді? Сdk әсерінен. Бұл жағдайда E және Cdk циклині жасушаның S фазасына ауысуы кезінде репликацияның басталуын ынталандырады, ал А және Цдк циклині G2 фазасында оны тежейді.

Жоғарыда айтылған «ерте және кеш белсенді» бастаулардың жандануы анық S.cerevisiae Dbf4 / Cdc7p киназасына байланысты. Мүмкін, әр шығу кезінде оның қызметі жергілікті қосымша ақуыз киназалармен реттеледі, мысалы, Rad53. Kinase Rad53 S-фазасының басында «кеш белсенді» шығу тегі басталуын блоктайды. Бұл тосқауыл жойылғанда, Dbf4 / Cdc7p киназасы МСМ белсендіреді, бұл бірден бірнеше салдарға әкеледі: МСМ -нің геликаза белсенділігін ынталандыру және РРА ақуызы мен ДНҚ полимеразасын байланыстыру? репликацияның пайда болуымен. ДНҚ -полимеразаның қосылуы? RC -ге, РНҚ праймерінің пайда болуында және синтезінде ДНҚ -ның ашылуы эукариотты ДНҚ -ның репликациясын бастайды. Айта кету керек, ДНҚ полимеразаның рөлі? тек ДНҚ репликациясын бастауымен шектеледі. Бұл ДНҚ полимеразасы ДНҚ синтезін өңдеуге қабілетті емес, түзетуші белсенділікке ие емес. Сондықтан, болашақта репликация процесінде РНҚ праймеріне 20 -ға жуық нуклеотид қосады және оның орнын ДНҚ полимеразалары басады? немесе ?.

ДНҚ репликациясының басталуының барлық оқиғалар тізбегі басталатын пост-РК жасушалық циклдің S фазасында өзгерістерге ұшырайды. Бұл өзгерістер ДНҚ үшін ORC аффинитетіне қатысты. Мысалы, Orc1 Гепорлар pge-RC құрастыру аяқталғанға дейін ерте интерфазада хроматинмен күшті кешен түзеді. Содан кейін S-фазада Orcl ДНҚ-ға жақындығы төмендейді. Сүтқоректілерде Orc1 хроматиннен S фазасында диссоциацияланып, моно немесе ди-ubikuitinated түрге айналады, содан кейін de-ubiquitinated емес және M- G-1 фазасына өту кезінде ДНҚ-мен қайта байланысады. Ақуыз Ogs2, керісінше,

жасушаның бүкіл циклі бойы хроматинмен байланысады және барлық жерде орналасу үшін субстрат болып табылмайды. Адам жасушаларында S-фазада құрамында Ogc1 және Ogc2 ақуыздар кешені митоздың соңында қайта ассоциацияланатын хроматиннен диссоциацияланады. Ашытқы жасушаларында S.rotbe ORC жасуша циклінде пост-трансляциялық өзгерістерге ұшырайды: S фазасында G2 және M фазаларында максимумға жететін Orc2 қосалқы бірлігінің фосфорлануы басталады, осылайша эукариотты жасушаларда қайталанатын репликацияны болдырмайтын механизмдердің бірі. Репликацияланған хроматиннің өсуі Orc1 диссоциациясы арқылы (жоғары эукариоттарда) немесе Orc2 фосфорлануымен (төменгі эукариоттарда) -RС өсуінің инактивациясымен байланысты.

кесте 2

Эукариоттардағы транскрипцияның инициациялық кешендері

Репликацияның басталу аймағындағы әр түрлі ақуыздардың байланысу тізбегін түсінуді жеңілдету үшін 2 -кестені қараңыз.

Соңғы бірнеше жылда репликацияның әр кезеңінің реттелу механизмін түсінуде айтарлықтай жетістіктерге қол жеткізілді. Олар пост, алдын ала және репликативті кешендерді құрайтын барлық компоненттердің жұмыс істеу деңгейінде жүзеге асады. Бұл компоненттерге бір емес, әр түрлі факторлар әсер етеді. Бұған мысал ретінде белсенділігі Cdc6, Mst10, Cdt1 ақуыздарына, циклинге тәуелді киназаларға, Dbf4 / Cdc7 киназасына және фосфатазаларға тікелей тәуелді MSM кешенінің реттелуін айтуға болады. Осы уақытқа дейін эмбриогенездегі ДНҚ репликациясының басталу процесінің заңдылықтары мен осы процестерге әсер ететін факторлар нашар түсінілген.

4 тарау. РНҚ праймерінің пайда болу механизмі мен қажеттілігі

4.1. Полимеразды реакцияға арналған праймердің синтезі

ДНҚ полимеразалары ДНҚ синтезін шаблон бойынша тікелей бастай алмайды, бірақ бар полинуклеотидтік тізбектің 3 дюймдік ұшына жаңа дезоксирибонуклеотид бірліктерін қосады. Нуклеотидтер қосылатын осындай алдын ала түзілген тізбек праймер (немесе праймер) деп аталады. РНҚ -дан тұрады РНҚ -ның қысқа праймері рибонуклеозид трифосфаттарынан ДНҚ примазасы деп аталатын ферментпен синтезделеді. Примаза белсенділігі бір ферментті немесе ДНҚ полимеразасының суббірліктерінің бірінде болады. РНҚ праймері.РНҚ праймерлері прокариоттарда ІІІ ДНҚ полимераза мен эукариоттарда ДНҚ полимераза β әсерінен ұзарады. E.coliпраймерлер арнайы бөлек фермент - синтезделген.

Күріш. 8. Артқы тізбектегі РНҚ праймерлері

4.2. РНҚ-ДНҚ дуплексі туралы түсінік

ДНҚ әдетте жасушада В түрінде болады. Сонымен қатар А және З ДНҚ күйінің тағы екі мүмкін формасы сипатталған.Бұл формалар суретте көрсетілген. 9. В түріндегі негіздердің өзара әсері суретте көрсетілген. он.

А-түрінде базалық жазықтықтар спираль осіне перпендикуляр 20 градус бұрыш жасайды (В түрінде-0), негізгі жұптар арасындағы қашықтық 0,29 нм-ге дейін қысқарады (В түрінде) - 0,34 нм), бір айналымдағы жұптар саны 11–12 дейін өседі (В-формада 10).

А формасындағы негізгі жұптар спираль осінен молекуланың шетіне дейін өте алыс орналасқан-радиустың жартысына жуығы; ығысу 4-5 А дейін жетеді, ал ДНҚ В түрінде ол нөлге жақын.

Күріш. 9. ДНҚ -ның мүмкін болатын формалары

Праймер пайда болған кезде (оның синтезі процесі ДНҚ полимеразасын сипаттау кезінде толығырақ ұсынылатын болады? Эукариоттар), А-түрінде болатын ДНҚ-РНҚ дуплексі түзіледі. Сонымен

Осылайша, дуплекстің А-формасы шаблон негізі мен праймер арасындағы гидрофобты және комплементарлы өзара әрекеттесулер арасындағы оңтайлы тепе-теңдікті қамтамасыз етеді.

Күріш. он. Өзара реттеуДНҚ-да нуклеотидтер В түрінде болады

4.3. ДНҚ синтезіне қатысатын негізгі ферменттер

ДНҚ репликациясы процесінің көптеген мәліметтері репликация аппаратының жұмысын қамтамасыз ететін ферменттердің әрекеті мен белсенділігін зерттеу арқылы анықталды. Бактериалды ДНҚ репликациясының ең толық зерттелген механизмі, әсіресе ДНҚ E. coliжәне онда көбейетін бактериофагтар. Ашытқы репликациясының ферменттері өте жақсы белгілі, Дрозофила,сүтқоректілер.

4.3.1. ДНҚ полимераза

ДНҚ подсимразалары барлық прокариоттық және эукариоттық жасушаларда болады. Сонымен қатар, бактериялар мен жануарлардың көптеген вирустары ДНҚ полимеразаларының немесе протеиндердің түзілуін тудырады, бұл ДНҚ полимеразаларының вирустық ДНҚ репликациясына қатысуын жеңілдетеді.

Көптеген прокариоттық және эукариоттық ДНҚ полимеразалары таза күйінде оқшауланған, олардың физикалық және ферменттік қасиеттері егжей -тегжейлі сипатталған. Бұл қасиеттер мүлдем ұқсас болмаса да, бұл ферменттердің катализінің механизмі жалпы контурбірдей.

Күріш. 11. ДНҚ полимеразаларының құрылысының жалпы принципі.

Эукариотты ДНҚ полимеразаларының бастапқы құрылымында прокариотты ферменттердің сәйкес мотивтеріне гомологты сақталған мотивтер бар. Бұл барлық ДНҚ синтездейтін ферменттердің ортақ құрылымдық жоспарының бар екенін растайды. ДНҚ полимеразаларының құрылымының жалпы принципі суретте көрсетілген. 11. ДНҚ полимеразаның пішінін жартылай ашық щеткамен салыстыруға болады оң қолонда алақан, бас бармақ және басқа саусақтар үш негізгі кеңістіктік доменді білдіреді және синтез кезінде ДНҚ шаблонын және праймерін ұстайтын қуысты құрайды. А, В және С консервативті мотивтері алақан аймағында белсенді орталықты құрайды, саусақтар бір жіпшелі матрицаны ұстайды, ал бас бармақ-матрицаның қос тізбекті аймағын басады.

Бұл модельді эукариотты ДНҚ полимеразаларының әр түріне өзгертуге болады. ДНҚ полимеразалары репликациялық шанышқыда ұстайтын түрлі ақуыздық кешендермен бірге жұмыс істейді. Олар көбінесе «қысқыш» және «жылжымалы қысқыш», «қысқыш тиегіш» деп аталады.

ДНҚ-полимеразаны қысқышпен біріктіргеннен кейін, «клип тиегіш» реакция орнынан алыстайды, бірақ ДНҚ-полимераза диссоциацияланғаннан кейін праймер-шаблонды жаңа одақтық жерге жүктеу үшін артта қалуға жақын тұрады. алдыңғы Оказаки фрагментінің синтезін аяқтау. Бұл процесс суретте схемалық түрде көрсетілген. 12. Эукариоттардағы бұл кешендердің егжей -тегжейлері мен олардың репликациядағы рөлі төменде талқыланады.

4.3.1.1. Прокариоттардың ДНҚ полимеразасы

Прокариотты полимеразалар рим цифрларымен белгіленеді (грек әріптерімен белгіленген эукариотты полимеразалардан айырмашылығы). Ең толық зерттелген ДНҚ полимераз I (Po11) E. coli.Бұл көп функциялы әрекеті бар жалғыз полипептид. ДНҚ полимеразасы ретінде Po11 Дезоксинуклеозид-5'-трифосфаттардың 5'-дезоксинуклеотидил бірліктерінің ДНҚ немесе РНҚ тізбегіндегі 3'-ОН тобына ауысуын катализдейді, содан кейін берілген база комплементарлы ДНҚ-ның сәйкес негізімен жұптасады. ферментке дезоксинуклеотидтің акцепторы ретінде праймер мен керекті нуклеотидті бекітуді анықтайтын шаблон қажет.Нуклеотидтердің полимерленуінен басқа, Po11 басқа екі реакцияны катализдейді, биологиялық рөлібұл өте маңызды. Олардың бірінде фосфодиэфирлік байланыстар бір ДНҚ тізбегінде немесе дуплексті ДНҚ -ның жұпталмаған ұшында гидролизденеді, ал бір нуклеотид тізбектің 3 «ұшынан бастап бір әрекетте жойылады. ( 3 «-5» экзонуклеаза). Екінші реакция нуклеотидтердің бөлінуінен тұрады, бірақ гидролиз қос тізбекті ДНҚ-ның 5 «ұшынан 3» соңына қарай (5 «-3» экзонуклеаза) басталады. Бұл әр түрлі әрекеттер полипептидті полипептидтік тізбектің әр түрлі учаскелеріне тән.Егер полиомиелит трипсинмен in vitro жағдайда өңделсе, полипептидтік тізбек үлкен және кіші фрагменттерге бөлінеді. Үлкен, С-терминалды фрагмент («Кленов фрагменті») ДНҚ полимеразасын және 3 «-5» экзонуклеаза белсенділігін сақтайды; кішкентай N-терминал фрагменті тек 5 «-3» экзонуклеазалық белсенділікке ие.

Полиомиелит және оның экзонуклеаза белсенділігі хромосомалық ДНҚ репликациясы мен қалпына келуінде өте маңызды рөл атқарады. E. coli. 3'-5 «экзонуклеаза белсенділігі әрбір нуклеотидтің бекітілуін және жаңадан синтезделген тізбектің қате нуклеотидтерін жоюды бақылауды қамтамасыз етеді. Егер бұл белсенділік PolI кодтайтын геннің кейбір мутацияларының нәтижесінде басылса, онда геномның репликациясы кезінде, мутациялар жиі кездеседі - базалық алмастырулар.

ДНҚ -полимеразаның шаблондық жіппен жұптасқан жіптің 3 «ұшын ұзарту қабілеті артта қалған жіп сегменттері арасындағы саңылауларды толтыруға мүмкіндік береді. PolI 3» ұшынан Оказаки фрагменттерін кеңейтеді және одан 5 «праймерлік рибонуклеотидтерді жояды. іргелес фрагменттердің ұштары басталады, бұл үздіксіз артта қалудың пайда болуының міндетті шарты болып табылады, өйткені PolI екі тізбекті ДНҚ үзілісінде жіптердің бірінің 3 «ұшын созуға және 5» ұшынан нуклеотидтерді шығаруға қабілетті. сол үзілістің (ник аудармасы деп аталатын процесс ), Бұл фермент зақымдалған ДНҚ -ны қалпына келтіруде маңызды рөл атқарады. Ник аудармасы in vitro радиобелсенді ДНҚ синтезі үшін кеңінен қолданылады.

Бар E. coliбасқа екі ДНҚ полимеразасы бар, бірақ олар жасушада аз мөлшерде болады. РолII нуклеотидтерді Ро11 -ге қарағанда әлдеқайда тиімді қосады және 5 «-3» -эконуклеаза белсенділігіне ие емес. Демек, PolII шаблон тізбегімен жұптасқан ДНҚ фрагменттері арасындағы бос орындарды толтыра алады, бірақ Оказаки фрагменттерінен РНҚ нуклеотидтерін ажырата алмайды немесе лақап аударманы орындай алмайды. PolII -дің хромосомалық ДНҚ репликациясы мен сақталуындағы рөлі E. coliәзірге түсініксіз. Репликация шанышқысы зақымданғаннан және тоқтағаннан кейін ол ДНҚ синтезін қалпына келтіруге қатыса алады. Бұл процесс резинтез деп аталады.

PolIII-холоэнзим-хромосомалық ДНҚ репликациясына жауап беретін негізгі фермент E. coli.Әр ұяшықта холиноэнзим PolIII -нің 10-20 данасы ғана бар, бірақ мультифермент полимераза кешенінің негізгі компоненті болып табылатын бұл холофермент, ол репликацияның басталуында репликативті шанышқылардың пайда болуын бастайды, жетекшінің созылуына қатысады. шанышқымен байлап, РНҚ праймерлерін Оказаки фрагменттерін қалыптастыру үшін созады. PolIII холоэнзимі 5 «-3» экзонуклеаза белсенділігіне ие болмағандықтан, артта қалған тізбектің репликациясы PolIII қатысуымен түзілген өнім ұзарып, РНҚ праймерлерін алып тастау үшін Поли қатысуын қажет етеді. 5 «Оказаки фрагменттерінің соңы.

Бағытталған мутациялық талдау әдісі PolIII негізгі (негізгі) ферментінің полипептидтік тізбегіндегі өзгерістерді анықтады және ферменттік кешеннің арнайы бөлімшелеріне ферменттік белсенділіктің жекелеген түрлерін беруге мүмкіндік беретін аминқышқылдарының алмастыруларын зерттеді. Осылайша, α-қосалқы бірлік полимеразалық белсенділікке ие, ал α-суббірлік 3 «5» экзонуклеазаға ие. Алайда, α және β қосалқы бірліктерінің комплексі сәйкес келетін әрбір бірлікке қарағанда полимеразалық және экзонуклеазалық белсенділікке ие. Үшіншінің қызметі? -Субунит әлі де түсініксіз.

PolIII-ядроны құрайтын қосалқы бірліктерден басқа, PolIII-холофермент тағы жеті қосалқы бөліктен тұрады:?,?,?,?,? ’,?, Және?. Тізімдегі полипептидтер бірнеше көшірмелерде де бар, сондықтан олар айтады. полимераза кешенінің массасы шамамен 10 3 кДа құрайды. ? -Субуниттің рөлі -көшіру процесі аяқталғанға дейін ферменттің үлгінен бөліну ықтималдығын азайту, яғни ол «қысқыш» қызметін атқарады. Бөлімше? репликативті холоферменттердің димерлену факторы болып табылады. Басқа бөлімшелердің нақты қызметі белгісіз. PolIII-холоферментінің екі формада болуы әбден мүмкін, олардың әрқайсысында ферментке белгілі бір қасиеттер беретін көмекші қосалқы бірліктердің белгілі бір жиынтығы бар. Бір формада фермент үздіксіз жетекші тізбектің синтезін катализдейді, ал екіншісінде үзіліссіз артта қалу тізбегі.

PolIII-холоэнзим ПолИ сияқты синтез реакцияларын катализдейді, бірақ шамамен 60 есе жылдам жұмыс істейді. Сонымен қатар, PolIII холоферменті матрицаға жақындығын жоғарылатады және көшірудің жоғары тиімділігін қамтамасыз етеді. PolIII холоферменті басқа ақуыздармен байланысып, репликациядағы кейбір маңызды ферментативті қадамдарды үйлестіру арқылы көшіру процесінің тиімділігін арттырады. Бұл туралы толығырақ жоғары деңгейҰйымдар, кешендерге ДНҚ спиралын репликацияның басталуында және репликативті шанышқыларда (геликазаларда) бұралатын, праймер РНҚ (примазалар) түзілуін бастайтын, ДНҚ тізбектерінің дәйекті кеңеюін қамтамасыз ететін, репликация процесін тоқтататын және қызын бөлетін ақуыздар кіруі мүмкін. ДНҚ спиралдары.

Басқа бактериялар мен көптеген бактериофагтар синтездеген ДНҚ полимеразалары физикалық құрылысы мен қасиеттерімен ерекшеленеді. Соған қарамастан, олар катализдейтін реакциялар зерттелгендермен бірдей E. coli.Барлық ДНҚ полимеразаларында түзетуші 3 «-5» экзонуклеаза бар, бірақ көптеген ферменттерде 5 «-3» экзонуклеазалар жоқ. Мысалы, Т4 ДНҚ полимеразасы 3 «-5» экзонуклеаза реакциясын жүргізе алады және репликация қателерін түзете алады, бірақ 5 «- 3» экзонуклеаза реакциясын катализдей алмайды, сондықтан ник аудармасын қамтамасыз ете алмайды. Т4 5 «-3» фекс ДНҚ репликациясы кезінде оказаки фрагменттерін біріктірместен бұрын РНҚ праймерлерінің жойылу реакциясы фагпен кодталған басқа ақуызмен катализденеді. Кешіктірілген тізбектердің синтезі мен Т4 фагындағы ДНҚ зақымының түзелуі кезінде бұл фермент ДНҚ -полимеразалық фагпен бірге жұмыс істейді. Кейбір жануарлар вирустары (мысалы, герпесвирус, вакциния және гепатит вирусы) олардың геномдарын қайталау үшін арнайы полимеразалардың синтезін тудырады.

Басқа вирустар жасушалық ДНҚ репликация жүйесін ынталандыратын немесе вирустық ДНҚ репликациясына қатысатын белоктар түзеді. Мысалы, паповирустар репликацияны бастау үшін қажетті ақуыздарды синтездейді. Адам аденовирустары сызықтық вирустық ДНҚ -ның екі тізбегінің синтезінің басталуын «қоздыратын» белоктарды кодтайды. Олар сонымен қатар репликацияны жеңілдететін ДНҚ байланыстыратын арнайы белоктар шығарады.

4.3.1.2. Эукариотты ДНҚ полимераза

Эукариот жасушаларында көптеген ДНҚ полимеразалары анықталды, бірақ олардың физикалық және функционалдық қасиеттері сәйкес прокариотты ферменттерге қарағанда аз зерттелген.

3 -кесте

Эукариотты ДНҚ полимераза

Рентгендік дифракциялық талдау арқылы анықталатын нақты кеңістік құрылымы басқа эукариотты ДНҚ полимеразаларынан айтарлықтай ерекшеленетін бір эукариотты ДНҚ полимеразасы үшін белгілі, β типті полимераза. Негізгі эукариотты полимеразалардың қысқаша мазмұны 3 -кестеде көрсетілген.

4.3.1.3. ДНҚ полимераза? - примаза

Эукариоттық жасушаларда ДНҚ синтезі негізінен диффузды ядролық матрицаға бекітілген нақты тығыз құрылымдарда («репликативті фабрикаларда») жүреді. Фосфолипидтер ядролық матрицаның молекулалық ұйымында белгілі бір рөл атқарады және ДНҚ ядролық қаңқамен гидрофобты әсерлесу арқылы байланысады деп болжанады. «Репликативті фабрикалар» немесе 21S репликативті комплекстері құрамында молекулалық массасы 15 -тен 300 кДа дейін кемінде 30 ақуыздан тұратын ферменттер тобы бар және құрамында ДНҚ полимеразасы бар? -примазалар сонымен қатар 3 «-5» -эконуклеаза, ДНҚ лигазасы I, РНаза Н, ДНҚ топоизомеразасы I, ДНҚ геликазасы, ПКНА және басқа да бірқатар факторлар. Бұл кешен сонымен қатар полимераза-примаза кешенінің p48 суббірлігімен нақты әрекеттесетін RRA-ны қамтиды. ДНҚ -полимеразаның маңызды жеткізілімі? ерте даму кезінде ядролық ДНҚ -ның қарқынды репликациясын қамтамасыз ету үшін эхинодерма, қосмекенділер, телостосттар мен дрозофилалардың ооциттерінде жиналады.

Әдетте ДНҚ полимераза? 3 «-5» экзонуклеазаның түзету белсенділігі жоқ. Алайда, 182 кДа ДНҚ полимеразасының каталитикалық бөлімшесінде? Дрозофилада 3 «-5» -эконуклеаза табылды, ол 73 кДа қосалқы бөлігін диссоциациялағанда ғана белсенділік көрсетеді.

ДНҚ полимеразасының мультипротеинді формасы? сонымен қатар құрамында динуклеотид диаденозин тетрафосфатын байланыстыратын ақуыз бар (Ap 4 A). Ap 4 A ДНҚ репликациясына және жасушалардың бөлінуіне қатысады деп болжанады. ДНҚ полимеразасының қабілеті туралы мәліметтер бар ма? праймер ретінде Ap 4 A пайдаланыңыз. Алайда, in vivo праймер ретінде Ap 4 A қатысуы екіталай; керісінше, ол эффектор ретінде қолданылады. Бір қызығы, бұл динуклеотидті синтездейтін триптофанил-тРНҚ синтетазы сол көп ақуызды кешенде орналасқан.

Әдетте примаза-полимераза комплексі? төрт бөлімшеден тұрады: молекулалық массасы 180 кДа болатын үлкен бөлімше немесе 140-160 кДа өлшемді полипептидтер отбасы; шамамен 68-70 кДа молекулалық салмағы бар қосалқы бірліктер және 54-58 және 46-50 кДа молекулалық салмағы бар екі кіші бірлік. P180 қосалқы бөлігі полимераза функциясына жауап береді. Примаза белсенділігі екі кіші бірлікпен байланысты. Бұл жағдайда 48 кДа қосалқы бөлігі каталитикалық болып табылады және ДНҚ праймингін тікелей орындайды, ал 58 кДа суббірлігі инициалды пуриндік нуклеотидті байланыстыруға және р48 қосалқы бөлігін ДНҚ полимеразасына бекітуге қатысады. Бұл сонымен қатар полимерлену жылдамдығына және 48 кДа суббірлігімен синтезделген өнімнің тұрақтылығына әсер етеді. p58 сонымен қатар p48 цитоплазмасынан ядроға енуін жеңілдетеді. P180 қосалқы бөлігі p58 -мен тікелей өзара әрекеттеседі.

Каталитикалық суббірлік каталитикалық полипептидті жасуша ядросына тасымалдау үшін қажет 68-70 кДа суббірлікпен байланысты. 68-70 кДа суббірлігі ДНҚ полимеразасының деңгейін реттеуге қатысады? жасушада каталитикалық полипептид синтезін ынталандырады. ДНҚ полимераза β-примаза комплексі төрт суббірліктерден тұрса да, бұл комплекстің сандық құрамы әр түрлі болуы мүмкін. Мүмкін полимераза шығар? және примаза 1: 3 қатынасында «қыртыста» болады.

4.3.1.4. Бастапқы реакция

Кешіктірілген тізбек бойынша репликация мен үзіліссіз ДНҚ синтезінің басталуы РНҚ-праймер механизмі арқылы жүреді және про- мен эукариоттарда ДНҚ репликациясының әмбебап қасиеті болып табылады.

ДНҚ примазасы басқа РНҚ -полимеразалардан бірегей қасиеттерімен ерекшеленеді. Біріншіден, матрица мен субстрат ерекшелігі. Екіншіден, ерекше процестілік бойынша - 10 -нуклеотидтік бірліктерге еселенген мультимерлердің синтезі. Үшіншіден, РНҚ мен ДНҚ полимеразаларының кейбір ингибиторларына төмен дәлдік пен төзімділік. Бұл жерде РНҚ праймерлерінің синтезі мәселесіне қайта оралу қажет. Табиғи шаблондардағы РНҚ праймерлерінің синтезі бірнеше жерде басталады, бірақ кездейсоқ емес, оның басталуы ATTP немесе GTP көмегімен, тіпті жоғары CTP және UTP концентрациясында болады. Мысалы, SV40 вирусының ДНҚ -сы 7-25 пиримидин нуклеотидтері аймақтарында орналасқан 3 «-dCTTT немесе 3» -dCCC таңдаулы инициация алаңдарын қамтитыны көрсетілді. ATP / GTP жоғары коэффициенті 3 «-dCTT аймақтарында инициация ықтималдығын арттырады, ал 3» -dCCC аймақтарында төмен коэффициент. Осылайша, NTP концентрациясы мен шаблонның нуклеотидтер реттілігі инициация орындарын анықтайды. Алайда in vivo инициация алаңдары SV40 ДНҚ репликациясы кезінде қолданылатын инициация алаңдарынан айтарлықтай ерекшеленеді. Көптеген жағдайларда 5 «-YYYYYYYCTTTYYYY-3» тізбегі табылды, онда Y = C немесе T, бұл ДНҚ полимеразасы бар кешеннің құрамында ДНҚ примазасының синтезін бастау үшін бастау алаңы болып табылады. Пиримидин кластерінің минималды ұзындығы кемінде 7 нт болуы керек. Пиримидиндердің біреуін кластердің 3 'соңында ауыстыру инициация жиілігін едәуір төмендетеді, ал кластердің ішіндегі және сыртындағы алмастырулар бастапқы нүктенің ығысуына әкеледі.Қалыпты ДНҚ примазасының өзі танитыны белгілі. Жаңадан синтезделген праймердің бастапқы нуклеотиді әрқашан пурин болады).

Бұл кешеннің тағы бір ерекше қызметі бар - сүтқоректілердің теломерлі ДНҚ тізбегінің синтезі ДНҚ полимераза β -примаза арқылы жүзеге асады.

ДНҚ примазасы - салыстырмалы түрде баяу фермент. Бұл ферменттің NTP қосылуының орташа жылдамдығы β ДНҚ полимеразасының dNTP қосылу жылдамдығынан шамамен екі есе төмен. ДНҚ полимераза? праймерді ұзындығы 7-10 нт-ден ұзарта алады. Ұзындығы 2-6 нс болатын өнімдер. ДНҚ полимеразасына субстрат емес пе? және абортивті деп аталады, РНҚ праймері ДНҚ полимеразының синтезіне дейін? және ДНҚ примазасы дербес әрекет етеді, содан кейін олардың қызметі үйлестіріледі. Синтезделген РНҚ праймері ерітіндіге диссоциацияланбастан полимеразаның белсенді орнына өтеді. Үлгісі бар дуплекстегі праймердің бұл молекулааралық қозғалысы жылдам және праймер синтезімен салыстырылады. ДНҚ полимеразадан кейін? праймерді ұзартады, примаза жаңа праймерді синтездей бастайды және цикл қайталанады. Эукариотты ДНҚ примазасы басқа РНҚ -полимеразалардан дезоксирибонуклеотидті праймерге қосу мүмкіндігімен ерекшеленеді, прокариотты примаза да осындай қасиетке ие. Праймердің 3 'соңына dNTP енгізу қажеттілігінің ықтимал түсіндірулерінің бірі - ДНҚ -ның А түрінен В түріне көшу қажеттілігі.Сондықтан «ауысу» механизмін түсіну. РНҚ синтезінен ДНҚ -ға дейінгі ДНҚ полимераза β примаза кешені өте үлкен маңызы... Примазалардың рибо мен дезоксириботрифосфаттарды бір мезгілде тану қабілеті үлкен ғылыми қызығушылық тудырады.

РНҚ праймерін таңдау ақуыз-нуклеин қышқылының өзара әсерлесуінің гидрофобты сипатымен анықталады. РНҚ-ДНҚ гибридті жағдайда, дуплекс шаблон негіздері мен праймер арасындағы гидрофобты және комплементарлы өзара әрекеттесу арасындағы оңтайлы тепе-теңдікті қамтамасыз ететін А-түрінде болады.

Бастамадан кейін праймердің өсуі протеиннің гидрофобты қуысынан шаблон негіздерінің өсіп келе жатқан РНҚ тізбегінің негіздерімен жұптасу үшін жүреді. Мұндай бәсекелестік жағдайында қысқа ди- және тринуклеотидтер абортты өнімдер түзе отырып, тез ажырайды. Праймер ұзындығының ұлғаюымен дуплексті беріктік артады, белсенді орталықтың гидрофобтығының әсері әлсірейді, ал базалық жұптар спираль осіне жақындайды. Праймер ұзындығы 7 н болғанда дезоксинуклеотидті қосуға және энергетикалық тұрғыдан неғұрлым қолайлы В-түріне көшуге жағдай жасалады. Бұл жерде NTP -ге қарағанда dNTP ферментіне үлкен жақындықты ескеру қажет. Ұсынылған тұжырымдама әмбебап болып табылады, өйткені ұқсас транскрипцияны бастау кезінде пайда болады.

ДНҚ полимераза? алдымен шаблонды, содан кейін праймер мен астарды байланыстырады. ДНҚ полимераза? ол ұзындығы кемінде 20-30 нт бос орындары бар қос тізбекті ДНҚ-да ең белсенді. ДНҚ полимеразамен матрицаның байланыс аймағы? өте ұзақ. Ол 9 n праймерлік тізбектің, 13 n қос тізбекті аймақтың және 14 n бір тізбекті шаблонның гидролизінен қатты қорғайды және осы аймақтан тыс бірнеше негізді әлсіз қорғайды. Фермент 19-20 н матрицамен иондық және гидрофобтық әсерлесу арқылы байланысады; бұл жағдайда байланыс тиімділігі матрицалық негіздердің гидрофобтығымен байланысты.

ДНҚ полимеразасының айрықша ерекшелігі? Бұл оның РНҚ праймерлерін кеңейту қабілеті және осы праймерлерді синтездейтін ДНҚ праймерімен тығыз байланысы.

ДНҚ полимеразасының орташа процестілігі? 20-50 т. Примаза динуклеотидтердің синтезі кезінде сирек қателеседі, бірақ кейін қате NTP -ті оңай қолданады. Қате нуклеотидтердің қосылу жылдамдығы шаблонның нуклеотидтер тізбегіне және дұрыс емес нуклеотидтің өзіне байланысты болса да, ДНҚ примазасы негізінен дәл емес нуклеотидті полимерлейтін фермент болып табылады. Кейбір жағдайларда 100 -ден аз дұрыс бір нуклеотид болады. Дұрыс емес нуклеотидті енгізу келесі дұрыс нуклеотидті енгізуге кедергі болмайды. Примаза ұқсас нуклеотидтерді полимерлей алады және одан әрі синтезді тежемейтін және қателігі бар праймерлерді генерациялай алады, және ДНҚ полимеразаның активті орталығына молекулярлық ауысқаннан кейін, ДНТП қатысуымен ДНҚ полимеразасымен ұзартылады.

Праймерлерді синтездеу механизмінің шаблонға қосымша болмайтын екі моделі бар. Бірінші модельге сәйкес, ферменттің құрамына тек матрицаны толықтырмайтын нуклеотидтер кіреді. Екінші модель шаблонға комплементарлы нуклеотидті қосуды, содан кейін шаблонға қатысты праймерді сырғытуды қамтиды. ДНҚ примазасының төмен дәлдігі РНҚ ДНҚ репликациясының тұқымы деген гипотезаға негіз болды. Алғашқы нуклеотидтер жаңадан өсіп келе жатқан тізбекке қате енгізілуі мүмкін болғандықтан, РНҚ праймері кейіннен алып тастау және дәлірек жинақтау үшін «өте қате» жерді белгілейді деп есептеледі. Бұл көзқарас сенімді көрінеді, бірақ, мүмкін, РНҚ праймерінің пайда болуының негізгі себебі РНҚ-ДНҚ дуплексінің А-формасы болған жағдайда ДНҚ синтезінің тиімдірек басталуымен байланысты.

Примазадан айырмашылығы, ДНҚ полимеразасы? бұл өте дәл фермент. Ол орташа есеппен 1/30 000 -нан 1 /50 000 -ға дейін қате жібереді. Ақуыздардың репликация факторлары синтездің ерекшелігін қамтамасыз етуде маңызды рөл атқарады. РПА болған жағдайда ДНҚ полимеразасының дәлдігі? көтеріледі. Белгілі болғандай, полимеразаның активті орталығында дұрыс және қате негіздік жұптардың түзілуінің бос энергиялары арасындағы айырмашылық сулы ортаға қарағанда 10 есе көп.

Жасушалардан бөлінген ДНҚ полимеразаның жоғары молекулалық формалары? ДНҚ полимеразасы мен примазасынан басқа басқа әрекеттері болуы мүмкін. Бұл кешендер жасушаның репликативті машинасының фрагменттері болып табылады. Жетекші тізбек ДНҚ полимеразасының репликациясын жүзеге асыратын кешенде? ДНҚ -полимеразамен байланысты ?, және кешіктірілген тізбекті комплексте ДНҚ -полимеразамен байланыстырады?. Эукариоттарда екі комплекс те репликативті шанышқымен бір -бірімен байланысқан болуы мүмкін, жетекші және тежелген жіптердің синтезінің холоферменттері прокариоттарда байланысқан сияқты. Бұған адам жасушаларынан синтезомалар деп аталатын және құрамында ДНҚ полимеразалары бар оқшаулану дәлел бола ма?,? және?, сонымен қатар ДНҚ примазасы, РФК репликативті факторы, ПКНА, поли (АДФ-рибоза) полимераза және ДНҚ лигазасы бар басқа да репликативті ақуыздар. kDa және 5 « -> 3» -эксконуклеаз мольмен. салмағы 47 кДа. ДНҚ полимеразамен? ашытқы MSM3 ақуызының гомологы болып табылатын тышқан жасушаларынан алынған Р1 ақуызы да байланыстырылуы мүмкін. Мейоз кезінде ДНҚ полимераза β-примаза комплексі диссоциацияланады.

SV40 (және басқа паповирустар) үлкен Т антигені ДНҚ полимераза β-примаза комплексіндегі p180 және p70 суббірліктерімен әрекеттеседі және осы кешенді өзіне қосады. oriвирус. Папиллома вирусы репликацияланғанда ДНҚ полимераза? E1 вирустық геликазасымен байланысты.

Жасушалық циклдегі комплекстің теріс реттелуі р180 фосфорлануына ғана емес, сонымен қатар циклинА-ға тәуелді киназалармен р68 суббірлік фосфорлануына байланысты. Ашытқы жасушаларында ДНҚ-полимераза β-примаза комплексі жасуша циклінің G1 және S фазаларында хроматинмен байланысады, бірақ G2 / M-де емес. Хроматинмен байланысу митоздың соңындағы 86 кДа суббірліктің дефосфорлануына байланысты (p70 гомолог).

4.3.1.5. ДНҚ полимераза? және?

ДНҚ полимераза? - молекулалық салмағы 125-130 кДа болатын каталитикалық қосалқы бірліктен және 48-55 кДа таралатын жасушалық ядролық антигеннің (ПКНА) процестік факторымен байланысу үшін қажет қосалқы бірліктен тұратын гетеродимер. Кішкене қосалқы бірлік ферменттің табиғи бір тізбекті матрицалардағы құрылымдық кедергілерді жеңуі үшін қажет. Шын мәнінде, ферменттің әрқайсысы молекулалық массасы 125 және 55 кДа болатын екі қосалқы бірлігі бар тетрамер болуы мүмкін, ал 55 кДа қосалқы бөлігі - бұл қосалқы бірлік сияқты репликативті холоферменттерді димерлеу факторы? ДНҚ полимеразасында III E. coli.ПНҚ, ДНҚ полимераза болмаған жағдайда? ұзын бір тізбекті матрицаларда төмен процестілікке ие, ал ПКНА болған жағдайда процестілік 10-100 есе артады. Детективті мутанттардың көмегімен ДНҚ полимеразасында? Тышқандарда каталитикалық полипептидтің N-терминалды аймағының 129-149 амин қышқылының қалдықтары PCNA байланысына жауап береді; С-терминал домені аз сақталған және ДНҚ-мен байланысатын екі тораптан тұрады.

ДНҚ полимераза холоферменті? PCNA технологиялық коэффициентін және RFC факторларын (репликация коэффициенті C) және RPA қамтиды, ол келесі тәртіпте праймер-шаблон комплексінде жиналады: біріншіден, RFC праймердің 3 «-OH-ұшымен бір тізбекті байланыстырады. RRA ақуызымен қапталған ДНҚ шаблоны Содан кейін АТФ қатысында ДНҚ дуплексінде праймердің 3 'ұшына іргелес орналасқан, әрқайсысы 36 кДа молекуласы бар үш ПКНА молекуласынан тұратын дөңгелек құрылым түзіледі, ал ПНҚҚА ДНҚ полимеразасының қосылуы? праймердің 3 «соңына дейін, осылайша жоғары тиімді холоферменттің түзілуін аяқтайды.

PCNA -ның өзінде RFC суббірліктерімен және ДНҚ полимеразаларымен байланысуға жауапты аймақтар анықталды. Полимеразадағы ДНҚ -дан басқа? 121-135 аминқышқылдарының қалдықтары қатысады, олар PCNA домендері арасында ілмек құрайды.

ДНҚ -полимеразаның 3 « -> 5» -экконуклеазиялық белсенділігі? сонымен қатар холофермент құрайтын факторлармен реттеледі. Көмекші факторлар болмаған жағдайда ДНҚ полимеразаның 3 «-> 5» экзонуклеазалық белсенділігі? төмен, бірақ RRA ақуызының, сонымен қатар ДНҚ полимеразаның қатысуымен ?, ол 8-10 есе артады. РРА-ның 3 «-> 5» экзонуклеаза белсенділігіне активтендіруші әсері осы ақуыздық кешеннің қатысуымен праймер-шаблон кешенінің тұрақсыздығына байланысты.

ДНҚ полимераза синтезі? жасуша циклінде транскрипция деңгейінде реттеледі. Фермент пен ақуыздың мРНҚ мөлшері G1 / S фазаларының шекарасында максимумға жетеді. ДНҚ полимераза синтезінің динамикасы? циклде ДНҚ полимеразасының динамикасына сәйкес келеді?. Бір қызығы, жасуша циклі кезінде PCNA синтезі β ДНҚ полимеразасының синтезімен байланысты; алайда PCNA құрамы тұрақты түрде жоғарылайды және G2 / M фазалық шекарасына дейін жоғары болып қалады. ДНҚ полимераза? фосфорланудың ең жоғары дәрежесі С. фазасына жататын фосфопротеид болып табылады, ДНҚ полимеразасының 125 кДа каталитикалық суббірлігінің фосфорлануы? Шамасы, G1 циклинге тәуелді ақуыз киназ cdk2 фазасына тән. Бір қызығы, каталитикалық бөлімшенің фосфорлануы оның ферменттік белсенділігіне әсер етпейді.

ДНҚ полимераза? адамда екі полипептид бар - 261 кДа каталитикалық және 55 кДа. ДНҚ полимераза? ашытқы бес кіші бірліктен тұрады: 256 кДа каталитикалық және 80, 34, 31 және 29 кДа қосалқы бірліктер. 80 кДа ДНҚ полимеразасының қосалқы бірлігі? ашытқы - сүтқоректілердің жасушаларынан ферментінің 55 кДа бөлімшесінің гомологы. Ферментативті белсенділіктер-ДНҚ полимеразасы және 3 «-> 5» экзонуклеаза-жоғары молекулалы полипептидпен байланысты, N-терминалы екі белсенділікті қамтамасыз етеді, ал жасушаның енуін бақылау үшін С-терминалды домен қажет. циклдің S фазасы.

ДНҚ полимераза холоферментінің ерекшелігі? ол ДНҚ полимеразасының холоферментімен салыстырғанда PCNA, RFC және RPA көмекші факторларына тәуелділігі төмен бе?. ДНҚ полимераза? ПКНА болмаған кезде бір жіпшелі өліктердің тұқымын процесті түрде ұзартуға қабілетті. Репликативті факторлардың толық жиынтығы болған жағдайда синтез процесі мен ДНҚ полимеразамен байланысу тиімділігі артады? праймермен. РРА ақуызымен қапталған ДНҚ матрицаларында PCNA, RFC және ATP факторлары «праймердің 3-ОН-ұшының тану кешенін» құрайды деп есептеледі. ДНҚ полимеразасының байланысатын жерімен сәйкес келеді? Бұл pspa-79 және pspa-90 штаммдарымен синтезделген PCNA ақуызының әр түрлі мутантты формалары сәйкесінше α және β ДНҚ полимеразаларымен әрекеттесе алмайтындығымен дәлелденеді. rspa -90 мутанты - ДНҚ полимераза?.

ДНҚ полимераза голоферменттерінің тағы бір айырмашылығы? және? ДНҚ синтезінің әр түрлі жылдамдығында жатыр. Оңтайлы жағдайда ДНҚ полимераза голоферментінің ДНҚ синтезінің жылдамдығы? шамамен холоэнзимнің ДН полимеразасы β синтезінің жылдамдығынан төмен дәреже тәртібі. Бұл айырмашылық репликациялық шанышқыдағы ДНҚ полимеразаларының әр түрлі қызметтеріне байланысты. Бір голофермент ДНҚ полимераза? ори аймағында синтезделген бір праймерді қолдана отырып, жетекші тізбектің жылдам және процессті синтезін жүзеге асырады және репликонның соңына жеткенде ғана диссоциацияланады және бірнеше ДНҚ полимеразды холоферменттер? әр фрагменттің басында ДНҚ полимераза β-примазамен синтезделген праймерлерді кеңейту арқылы Оказаки аймағындағы Оказаки фрагменттерін синтездей алады. Бұл жағдайда фрагменттің синтезі аяқталғаннан кейін диссоциациямен және келесі фрагменттің праймерімен байланыстырумен бірге жүретін β ДНҚ полимеразасының жылдам айналымы болуы керек. Кешіктірілген тізбектің фрагменттерін синтездеу кезінде, праймерлердің концентрациясы жоғары болғанда және бірнеше фрагменттерді бір мезгілде синтездеуге болатын кезде, полимерлену жылдамдығы бір Оказаки фрагментінен екіншісіне тез ауысуға қарағанда маңызды емес.

ДНҚ полимераза? және?, ДНҚ синтезі кезінде түзету қызметін атқаратын 3 « -> 5» -эконуклеазалық белсенділікке ие, бірақ жетекші және артта қалатын тізбектердің синтезі кезіндегі қателік көрсеткіштері әр түрлі. Бұл артта қалған тізбек ДНҚ -ның бір бөлігі ДНҚ полимеразасымен синтезделуіне байланысты ?, ДНҚ синтездеуге қабілетті үлкен сомақателер

4.3.1.6. ДНҚ полимераза?

Бұл полимераза митохондрияда локализацияланған және оның қызметі mtDNA репликациясымен және жөнделуімен байланысты. ДНҚ полимеразалары? ДНҚ полимеразасы бар 3-1-5 дюймдік экзонуклеазалық активтігі бар 125-140 кДа үлкен каталитикалық қосалқы бірлігінен және қызметі белгісіз 35-50 кДа қосалқы қондырғысынан тұратын гетеродимерлер mtDNA репликациясының ферменттері, ДНҚ полимеразасынан кодталған ба? Ядролық геном бойынша. ДНҚ полимеразасының бастапқы құрылымы? ДНҚ полимеразасына ұқсас E. coli,әсіресе каталитикалық орталықтар аймағында, N-терминалы 3 «-> 5» -эконуклеазия доменінде және С-терминал полимераза доменінде.

Тегін сынақ үзіндісі аяқталды.