Kinetika encimskih reakcij. Odvisnost hitrosti encimskih reakcij od koncentracije substratov, encimov, temperature. Kakšen je vrstni red encimske reakcije po encimu

Hitrost encimskih reakcij je odvisna od koncentracije sub-

stratum Ta odvisnost je kompleksna, ki jo pri nekaterih encimih opisuje parabolična krivulja (slika 29).

Slika 29 – Odvisnost hitrosti encimske reakcije

na koncentracijo substrata

Parabolična narava odvisnosti je razložena z dejstvom, da pri interakciji encima s substratom nastane kompleks encim-substrat. Na začetku se z večanjem koncentracije substrata poveča koncentracija encimsko-substratnih kompleksov v reakcijski zmesi, kar se kaže v vzporednem povečanju hitrosti reakcije. Pri določeni koncentraciji substrata (nasičenje) pride do nekakšne "nasičenosti" vseh aktivnih centrov encimskih molekul v reakcijski mešanici. Hitrost encimske reakcije pri nasičeni koncentraciji postane največja. Z nadaljnjim povečevanjem vsebnosti substrata v reakcijski mešanici se ta ne spremeni.

Iz grafa odvisnosti hitrosti encimske reakcije od koncentracije substrata se izračunata dva pomembna kazalnika:

1. Največja hitrost reakcije (V največ). Definirana je kot hitrost reakcije pri koncentraciji nasičenja substrata. Največja vrednost hitrosti odraža katalitično moč encima. Večji encimi V max so močnejši katalizatorji. Katalizirajo transformacijo večjega števila substratnih molekul na časovno enoto. Največja hitrost je izražena s številom vrtljajev encima. Število obrata je ocenjeno s številom substratnih molekul, ki jih encim pretvori na enoto časa (s -1). Za večino encimov je prometno število znotraj 10 4. Hkrati obstajajo encimi, za katere hitrost znatno več (600.000 za karbanhidrazo) ali manj od te vrednosti (100 za kimotripsin).

2. Michaelisova konstanta (TO m). Michaelisova konstanta je koncentracija substrata, pri kateri je hitrost reakcije polovična. Magnituda TO m odraža afiniteto encima za substrat. Večja kot je ta vrednost, manjšo afiniteto ima encim do substrata. TO m je izražen v molih substrata. Torej, vrednost TO m glede na glukozo za encim glukokinazo je 10 mmol, za heksokinazo pa 0,01 mmol. Heksokinaza ima večjo afiniteto za glukozo kot glukokinaza; pri enaki koncentraciji substrata pospešeno katalizira fosforilacijo glukoze.

Na podlagi matematične analize krivulje odvisnosti hitrosti encimske reakcije od koncentracije substrata sta L. Michaelis in M. Menten (1913) izpeljala formulo, ki omogoča oceno razmerja med hitrostjo reakcije, največjo stopnjo in Michaelisovo konstanto. Trenutno je definirana kot Michaelis–Mentenova enačba.

V o = V max [ S]/K m + [ S],

Kje V o – hitrost reakcije, S– koncentracija substrata.

Splošne lastnosti encimov

Kljub obstoju določenih razlik v strukturi, funkciji in znotrajcelični lokalizaciji so encimi značilni po številnih skupnih lastnostih. Ti vključujejo odvisnost manifestacije njihove katalitične aktivnosti od temperature (termolabilnost) in pH okolja ter specifičnost substrata.

Značilna lastnost encimov je termolabilnost. Ta pojav lahko ponazorimo z grafom hitrosti encimske reakcije v odvisnosti od temperature reakcijske mešanice (slika 30).

Slika 30 – Odvisnost hitrosti encimske reakcije od temperature

reakcijski medij ( t opt – optimalna temperatura; V- hitrost reakcije)

Kot je razvidno iz predstavljenega grafa, pri temperaturi blizu 4 o C encimske reakcije praktično ne potekajo. Zaradi tega lahko biološke predmete pred izvajanjem biokemičnih študij nekaj časa hranimo na hladnem. Mraz je tisti, ki omogoča, da se živila ohranijo pred avtolizo (samoprebavo).

Zvišanje temperature spremlja povečanje hitrosti encimske reakcije. Razlog za to je povečanje kinetične energije substrata in encimskih molekul, kar poveča hitrost interakcije med njimi. Podoben pojav opazimo do temperature, ki ustreza temperaturnemu optimumu encima. Temperaturni optimum encima ustreza temperaturi, pri kateri je hitrost encimske reakcije največja. Za encime toplokrvnih živali je običajno 28 o C ali 37 o C.

Nadaljnje zvišanje temperature reakcijske mešanice povzroči postopno zmanjšanje hitrosti encimske reakcije. Ta pojav je posledica procesa toplotne denaturacije proteinske polipeptidne verige. Denaturacijo spremlja sprememba strukture aktivnega centra encima, kar ima za posledico zmanjšanje afinitete encima do substrata. Pri temperaturah nad 55 o C večina encimov popolnoma izgubi katalitične lastnosti (inaktivira se). V zvezi s tem se za postopek pasterizacije pogosto uporablja segrevanje na 55–56 o C, kar poveča rok uporabnosti živil (mleko itd.).

pH okolja ima velik vpliv na hitrost encimske reakcije. Kot je razvidno iz prikazane slike. 31 graf, je po obliki podoben grafu odvisnosti hitrosti encimske reakcije od temperature.

Slika 31 – Odvisnost od hitrosti ( V) encimska reakcija

na pH okolja (pH opt – pH optimum encima)

Močno zmanjšanje hitrosti encimske reakcije pri ekstremnih vrednostih pH je povezano s pojavom denaturacije polipeptidne verige proteinske molekule pod vplivom kislin in alkalij. Encim ima največjo katalitično moč pri pH vrednosti, ki je določena s terminom pH optimalni encim. Večina znanih encimov ima optimalni pH v območju od 5,0 do 7,5. Hkrati obstaja veliko primerov encimov, pri katerih je pH optimalna vrednost premaknjena v območje kislih ali alkalnih pH vrednosti. Ti encimi vključujejo:

Razlog za obstoj odvisnosti hitrosti encimskih reakcij od pH je posledica dejstva, da ima pH vrednost medija izrazit vpliv na stopnjo ionizacije funkcionalnih skupin substrata. Značilnosti ionizacije molekule jantarne kisline pri različni kislosti okolja (pH):

Hkrati pa pH okolja vpliva tudi na stopnjo ionizacije aminokislinskih radikalov, ki sestavljajo aktivno središče encima:

Če se tvorba kompleksa encim-substrat stabilizira zaradi elektrostatičnih interakcij, postane jasna vloga pH pri zagotavljanju optimalnih pogojev za potek encimske reakcije (slika 24).

Hitrost reakcij, ki jih katalizirajo encimi, pri interakciji s substrati pa elektrostatične interakcije niso pomembne, je v manjši meri odvisna od pH medija. Na sl. Slika 32 prikazuje odvisnost hitrosti hidrolize beljakovin s papainom. Pri interakciji tega encima s substratom postanejo hidrofobne interakcije primarnega pomena. Kot je razvidno iz predstavljenega grafa, papain na splošno nima jasno definiranega pH optimuma.

Slika 32 – Vpliv pH na hitrost hidrolize beljakovin s papainom.

Encimi imajo določeno specifičnost glede podlage. Specifičnost se nanaša na sposobnost encimov, da katalizirajo transformacijo enega ali skupine strukturno podobnih substratov. Obstaja več vrst encimske specifičnosti.

· Absolutna specifičnost. Nanaša se na sposobnost encima, da katalizira transformacijo samo enega substrata. Encimi z absolutno specifičnostjo vključujejo arginazo, restrikcijske encime urikaze itd.

· Relativna specifičnost. Pomeni sposobnost encima, da katalizira transformacijo skupine substratov, podobnih strukturi (t. i. proteolitični encimi hidrolizirajo različne proteine, lipazne estre glicerola in višjih maščobnih kislin, heksokinaza fosforilira različne monosaharide). V tem primeru je specifičnost določena z dejstvom, da encim vpliva le na določeno vrsto vezi (proteolitični encimi hidrolizirajo peptidno vez, lipaza hidrolizira estrsko vez itd.).

· Stereospecifičnost . Ta izraz se nanaša na sposobnost encima, da katalizira pretvorbo enega stereoizomera substrata. Tako imajo encimi, ki sodelujejo pri pretvorbi monosaharidov, specifičnost glede na njihovo D-stereoizomeri in encimi, ki sodelujejo pri pretvorbi aminokislin - v njihove L-stereo-izomeri.

Aktivnost encimov

Posebnost encimov kot katalizatorjev je, da lahko spreminjajo svoje katalitične lastnosti pod vplivom različnih zunanjih dejavnikov. Merilo za moč katalitičnega delovanja encimov je njihovo dejavnost. Sposobnost encimov, da spremenijo svojo aktivnost pod različnimi pogoji, je zelo biološko smiselna. Ta lastnost omogoča živi celici, da prilagodi stanje presnovnih procesov neposrednim potrebam celic, ki se lahko bistveno spremenijo pod vplivom različnih zunanjih dejavnikov.

Določanje encimske aktivnosti igra pomembno vlogo pri njihovi karakterizaciji. Obstaja nekaj splošnih načel za kvantificiranje aktivnosti encimov. Aktivnost encimov je mogoče določiti na naslednji način:

· bodisi s hitrostjo kopičenja v reakcijski mešanici, kjer se nahaja encim reakcijskega produkta;

· ali s hitrostjo izginotja substrata encimske reakcije iz reakcijske mešanice.

Oba pristopa sta enakovredna in ju je mogoče uporabiti v praksi. Pri določanju encimske aktivnosti pa je treba upoštevati naslednje pogoje: v reakcijski mešanici, v kateri določamo encimsko aktivnost,

· temperatura mora ustrezati temperaturnemu optimumu encima;

· pH medija mora ustrezati pH optimumu tega encima;

· koncentracija substrata ne sme biti manjša od nasičene;

· kofaktorji morajo biti prisotni, če jih ima ta encim;

Prisotni morajo biti aktivatorji encimov.

Tako se aktivnost encima določi pod optimalnimi pogoji. Pod temi pogoji je aktivnost encima sorazmerna z njegovo vsebnostjo v testnem vzorcu in se zato lahko uporabi za posredno oceno njegove koncentracije.

Delovanje encimov je kvantitativno izraženo v enote dejavnosti. Ena enota encimske aktivnosti (U) je aktivnost encima, pri kateri pod njegovim vplivom nastane 1 µmol reakcijskega produkta (ali izgine 1 µmol substrata) na minuto.. V sistemu SI je enota encimske aktivnosti katal (kat). 1 katal ustreza encimski aktivnosti, pri kateri nastane en mol reakcijskega produkta (en mol substrata izgine) na sekundo.

Vrednost specifične aktivnosti se uporablja tudi za karakterizacijo encimov. Ta enota odraža aktivnost encima na enoto mase in je izražena v µmol/min mg proteina. Za oceno čistosti encimskih pripravkov se uporabljajo enote specifične aktivnosti. Večja kot je specifična aktivnost, čistejši je encimski pripravek.

Encimska kinetika preučuje vpliv različnih dejavnikov (koncentracije S in E, pH, temperatura, tlak, inhibitorji in aktivatorji) na hitrost encimskih reakcij. Glavni cilj preučevanja kinetike encimskih reakcij je pridobitev informacij, ki omogočajo globlje razumevanje mehanizma delovanja encimov.

Kinetična krivulja omogoča določitev začetne hitrosti reakcije V 0 .

Krivulja nasičenosti substrata.

Odvisnost hitrosti reakcije od koncentracije encima.

Odvisnost hitrosti reakcije od temperature.

Odvisnost hitrosti reakcije od pH.

Optimalni pH za delovanje večine encimov je v fiziološkem območju 6,0-8,0. Pepsin je aktiven pri pH 1,5-2,0, kar ustreza kislosti želodčnega soka. Arginaza, encim, specifičen za jetra, je aktiven pri 10,0. Vpliv pH na hitrost encimske reakcije je povezan s stanjem in stopnjo ionizacije ionogenih skupin v encimu in substratnih molekulah. Ta dejavnik določa konformacijo proteina, stanje aktivnega centra in substrata, nastanek kompleksa encim-substrat in sam proces katalize.

Matematični opis krivulje nasičenosti substrata, Michaelisova konstanta .

Enačbo, ki opisuje krivuljo nasičenosti substrata, sta predlagala Michaelis in Menton in nosi njuni imeni (Michaelis-Mentenova enačba): V = (V MAKS *[ S])/(Km+[ S]) , kjer je Km Michaelisova konstanta. Preprosto je izračunati, da ko je V = V MAX /2 Km = [S], tj. Km je koncentracija substrata, pri kateri je hitrost reakcije ½ V MAX. Za poenostavitev določanja V MAX in Km je mogoče znova izračunati Michaelis-Mentenovo enačbo. 1/V = (Km+[S])/(V MAKS *[S]), 1/V = Km/(V MAKS *[S]) + 1/V MAKS ,

1/ V = Km/ V MAKS *1/[ S] + 1/ V MAKS Lineweaver-Burkova enačba. Enačba, ki opisuje graf Lineweaver-Burk, je enačba premice (y = mx + c), kjer je 1/V MAX presečišče premice na osi y; Km/V MAX - tangens premice; presečišče premice z abscisno osjo daje vrednost 1/Km. Graf Lineweaver-Burk vam omogoča, da določite km iz relativno majhnega števila točk. Ta graf se uporablja tudi pri ocenjevanju učinka inhibitorjev, kar bo obravnavano v nadaljevanju. Vrednost Km je zelo različna: od 10 -6 mol/l za zelo aktivne encime do 10 -2 za nizko aktivne encime.

Ocene km imajo praktično vrednost. Pri koncentracijah substrata, ki so 100-krat večje od Km, bo encim deloval skoraj pri največji hitrosti, tako da bo največja hitrost V MAX odražala količino prisotnega aktivnega encima. Ta okoliščina se uporablja za oceno vsebnosti encimov v pripravku. Poleg tega je Km značilnost encima, ki se uporablja za diagnosticiranje encimopatij.

Zaviranje encimske aktivnosti.

Izredno značilna in pomembna lastnost encimov je njihova inaktivacija pod vplivom določenih inhibitorjev.

Zaviralci - to so snovi, ki povzročajo delno ali popolno inhibicijo reakcij, ki jih katalizirajo encimi.

Zaviranje encimske aktivnosti je lahko ireverzibilno ali reverzibilno, kompetitivno ali nekompetitivno.

Ireverzibilna inhibicija - to je vztrajna inaktivacija encima, ki je posledica kovalentne vezave inhibitorske molekule v aktivnem mestu ali v drugem posebnem centru, ki spremeni konformacijo encima. Disociacija takih stabilnih kompleksov z regeneracijo prostega encima je praktično izključena. Za premagovanje posledic takšne inhibicije mora telo sintetizirati nove encimske molekule.

Reverzibilna inhibicija – za katerega je značilno ravnotežno kompleksiranje inhibitorja z encimom zaradi nekovalentnih vezi, zaradi česar so takšni kompleksi sposobni disociacije z obnovitvijo encimske aktivnosti.

Razvrstitev inhibitorjev na kompetitivne in nekompetitivne temelji na tem, ali so oslabljeni ( tekmovalna inhibicija ) ali ne oslabljen ( nekonkurenčna inhibicija ) njihov inhibitorni učinek, ko se koncentracija substrata poveča.

Konkurenčni inhibitorji - to so praviloma spojine, katerih struktura je podobna strukturi substrata. To jim omogoča, da se vežejo na istem aktivnem mestu kot substrati, kar preprečuje interakcijo encima s substratom že v fazi vezave. Po vezavi se inhibitor lahko pretvori v produkt ali ostane na aktivnem mestu, dokler ne pride do disociacije.

Reverzibilna tekmovalna inhibicija lahko predstavimo kot diagram:

E↔ E-I → E + P 1

S (neaktivno)

Stopnja inhibicije encimov je določena z razmerjem koncentracije substrata in encimov.

Klasičen primer te vrste inhibicije je inhibicija aktivnosti sukcinat dehidrogenaze (SDH) z malatom, ki izpodrine sukcinat iz substratnega mesta in prepreči njegovo pretvorbo v fumarat:

Kovalentna vezava inhibitorja na aktivno mesto povzroči inaktivacijo encima (ireverzibilna inhibicija). Primer ireverzibilna tekmovalna inhibicija lahko služi kot inaktivacija triosefosfat izomeraze s 3-kloroacetol fosfatom. Ta zaviralec je strukturni analog substrata, dihidroksiaceton fosfata, in se ireverzibilno veže na ostanek glutaminske kisline v aktivnem mestu:

Nekateri zaviralci delujejo manj selektivno in delujejo s specifično funkcionalno skupino v aktivnem mestu različnih encimov. Tako vezava jodoacetata ali njegovega amida na skupino SH aminokisline cistein, ki se nahaja v aktivnem središču encima in sodeluje pri katalizi, povzroči popolno izgubo encimske aktivnosti:

R-SH + JCH 2 COOH → HJ + R-S-CH 2 COOH

Zato ti inhibitorji inaktivirajo vse encime, ki imajo SH skupine, ki sodelujejo pri katalizi.

Ireverzibilna inhibicija hidrolaz pod delovanjem živčnih plinov (sarin, soman) je posledica njihove kovalentne vezave na ostanek serina v aktivnem centru.

Metoda konkurenčne inhibicije je našla široko uporabo v medicinski praksi. Sulfonamidna zdravila, antagonisti p-aminobenzojske kisline, so lahko primer metaboliziranih kompeticijskih inhibitorjev. Vežejo se na dihidropterat sintetazo, bakterijski encim, ki pretvarja p-aminobenzoat v folno kislino, potrebno za rast bakterij. Bakterija umre zaradi dejstva, da se vezan sulfanilamid pretvori v drugo spojino in folna kislina ne nastane.

Nekompetitivni inhibitorji običajno vežejo na molekulo encima na mestu, ki je drugačno od vezavnega mesta substrata, in substrat ne tekmuje neposredno z inhibitorjem. Ker se inhibitor in substrat vežeta na različna centra, je možen nastanek tako kompleksa E-I kot kompleksa S-E-I. Kompleks S-E-I prav tako razpade, da nastane produkt, vendar počasneje kot E-S, zato se bo reakcija upočasnila, vendar ne ustavila. Tako lahko pride do naslednjih vzporednih reakcij:

E↔ E-I ↔ S-E-I → E-I + P

Reverzibilna nekonkurenčna inhibicija je relativno redka.

Imenujejo se nekonkurenčni zaviralci alosterični za razliko od konkurenčnih ( izosterično ).

Reverzibilno inhibicijo je mogoče kvantitativno preučiti z uporabo Michaelis-Mentenove enačbe.

S tekmovalno inhibicijo ostane V MAX nespremenjen in Km se poveča.

Z nekonkurenčno inhibicijo se V MAX zmanjša, medtem ko Km ostane nespremenjen.

Če produkt reakcije zavira encim, ki katalizira njegovo tvorbo, se ta metoda inhibicije imenuje retroinhibicija oz povratna inhibicija . Na primer, glukoza zavira glukoza-6-fosfatazo, ki katalizira hidrolizo glukoza-6-fosfata.

Biološki pomen te inhibicije je regulacija določenih presnovnih poti (glej naslednjo lekcijo).

PRAKTIČNI DEL

Naloga za študente

1. Preučite denaturacijo beljakovin pod vplivom raztopin mineralnih in organskih kislin ter pri segrevanju.

2. Določite koencim NAD v kvasovkah.

3. Določite aktivnost amilaze v urinu (krvni serum).

9. STANDARDI ODGOVOROV NA TEŽAVE, testna vprašanja za kontrolo znanja pri pouku (lahko kot priloga)

10. NARAVA IN OBSEG MOŽNEGA IZOBRAŽEVALNEGA IN RAZISKOVALNEGA DELA NA TEMO

(Natančneje navedite naravo in obliko UIRS: priprava abstraktnih predstavitev, samostojna raziskava, simulacijske igre, priprava anamneze z monografsko literaturo in druge oblike)

Encimska kinetika preučuje hitrost reakcij, ki jih katalizirajo encimi, odvisno od različnih pogojev (koncentracija, temperatura, pH itd.) Njihove interakcije s substratom.

Encimi pa so beljakovine, ki so občutljive na vpliv različnih zunanjih vplivov. Zato pri preučevanju hitrosti encimskih reakcij upoštevajo predvsem koncentracije reagirajočih snovi in ​​poskušajo čim bolj zmanjšati vpliv temperature, pH okolja, aktivatorjev, inhibitorjev in drugih dejavnikov ter ustvariti standardne pogoje. Prvič, to je pH vrednost okolja, ki je optimalna za določen encim. Drugič, priporočljivo je vzdrževati temperaturo 25 °C, kjer je to mogoče. Tretjič, doseže se popolna nasičenost encima s substratom. Ta točka je še posebej pomembna, ker pri nizkih koncentracijah substrata v reakciji ne sodelujejo vse encimske molekule (slika 6.5, A), kar pomeni, da bo rezultat daleč od največjega možnega. Največjo moč katalizirane reakcije ob drugih enakih pogojih dosežemo, če pri transformaciji sodeluje vsaka molekula encima, tj. pri visoki koncentraciji kompleksa encim-substrat (slika 6.5, V).Če koncentracija substrata ne zagotavlja popolne nasičenosti encima (slika 6.5, b), potem hitrost reakcije ne doseže največje vrednosti.

riž. 65.

A - pri nizki koncentraciji substrata; 6 - z nezadostno koncentracijo substrata; V - ko je encim popolnoma nasičen s substratom

Hitrost encimske reakcije, izmerjena pri zgornjih pogojih in popolni nasičenosti encima s substratom, se imenuje največja hitrost encimske reakcije (V).

Hitrost encimske reakcije, določena, ko encim ni popolnoma nasičen s substratom, je označena v.

Encimsko katalizo lahko poenostavimo z naslednjim diagramom:

kjer je F encim; S - substrat; FS - kompleks encim-substrat.

Za vsako stopnjo tega procesa je značilna določena hitrost. Merska enota za hitrost encimske reakcije je število molov substrata, pretvorjenih na časovno enoto(enako kot hitrost običajne reakcije).

Interakcija encima s substratom povzroči nastanek kompleksa encim-substrat, vendar je ta proces reverzibilen. Hitrosti naprej in povratnih reakcij so odvisne od koncentracij reaktantov in so opisane z ustreznimi enačbami:

V stanju ravnovesja velja enačba (6.3), saj sta hitrosti neposredne in povratne reakcije enaki.

Če nadomestimo vrednosti hitrosti reakcije naprej (6.1) in povratne (6.2) v enačbo (6.3), dobimo enakost:

Za stanje ravnotežja je značilna ustrezna ravnotežna konstanta K p, enaka razmerju konstante neposredne in povratne reakcije (6,5). Recipročna konstanta ravnotežja se imenuje substratna konstanta Ks, ali disociacijska konstanta kompleksa encim-substrat:

Iz enačbe (6.6) je razvidno, da se substratna konstanta zmanjša pri visokih koncentracijah kompleksa encim-substrat, tj. z veliko stabilnostjo. Posledično substratna konstanta označuje afiniteto encima in substrata ter razmerje konstant hitrosti za tvorbo in disociacijo kompleksa encim-substrat.

Pojav nasičenosti encima s substratom sta proučevali Leonor Michaelis in Maud Mepten. Na podlagi matematične obdelave rezultatov so izpeljali enačbo (6.7), ki je dobila svoje ime, iz katere je razvidno, da pri visoki koncentraciji substrata in nizki vrednosti substratne konstante hitrost encimske reakcije teži k maksimumu . Vendar je ta enačba omejena, ker ne upošteva vseh parametrov:

Kompleks encim-substrat med reakcijo se lahko transformira v različnih smereh:

• disociirajo na matične snovi;
• pretvorijo v produkt, iz katerega se nespremenjen loči encim.

Zato je za opis celotnega delovanja encimskega procesa koncept Michaelisove konstante Kt, ki izraža razmerje med konstantami hitrosti vseh treh reakcij encimske katalize (6.8). Če oba člena delimo s konstanto hitrosti reakcije za nastanek kompleksa encim-substrat, dobimo izraz (6.9):

Iz enačbe (6.9) sledi pomembna posledica: Michaelisova konstanta je vedno večja od konstante substrata za toliko k 2 /k v

Številčno K t enaka koncentraciji substrata, pri kateri je hitrost reakcije polovica največje možne hitrosti in ustreza nasičenosti encima s substratom, kot na sl. 6,5, b. Ker v praksi ni vedno mogoče doseči popolne nasičenosti encima s substratom, je prav K t uporablja se za primerjalno karakterizacijo kinetičnih značilnosti encimov.

Hitrost encimske reakcije, ko encim ni popolnoma nasičen s substratom (6.10), je odvisna od koncentracije kompleksa encim-substrat. Proporcionalni koeficient je reakcijska konstanta za sproščanje encima in produkta, saj se s tem spremeni koncentracija kompleksa encim-substrat:

Po transformacijah, ob upoštevanju zgornjih odvisnosti, je hitrost encimske reakcije, ko encim ni popolnoma nasičen s substratom, opisana z enačbo (6.11), tj. odvisno od koncentracije encima, substrata in njihove afinitete K s:

Grafična odvisnost hitrosti encimske reakcije od koncentracije substrata ni linearna. Kot je razvidno iz sl. 6.6, z naraščajočo koncentracijo substrata opazimo povečanje aktivnosti encimov. Ko pa je dosežena največja nasičenost encima s substratom, postane hitrost encimske reakcije največja. Zato je dejavnik, ki omejuje hitrost reakcije, tvorba kompleksa encim-substrat.

Praksa je pokazala, da so koncentracije substrata praviloma izražene v vrednostih, ki so veliko manjše od enote (10 6 -10 3 mol). S takimi količinami je v izračunih precej težko operirati. Zato sta G. Lineweaver in D. Burke predlagala izraziti grafično odvisnost hitrosti encimske reakcije ne v neposrednih koordinatah, temveč v inverznih. Izhajali so iz predpostavke, da so pri enakih količinah enake tudi njihove inverzne vrednosti:

riž. 6.6.

Po transformaciji izraza (6.13) dobimo izraz, imenovan Lineweaver-Burkova enačba (6.14):

Grafična odvisnost Lineweaver-Burkove enačbe je linearna (slika 6.7). Kinetične značilnosti encima so določene na naslednji način:

• segment, odrezan na ordinatni osi, je enak 1/V;
• segment, odrezan na abscisni osi, je enak -1 /Na t.

riž. 6.7.

Menijo, da metoda Lineweaver-Burk omogoča natančnejše določanje največje hitrosti reakcije kot v neposrednih koordinatah. Iz tega grafa je mogoče pridobiti tudi dragocene informacije o zaviranju encimov.

Obstajajo tudi drugi načini za transformacijo Michaelis-Mentenove enačbe. Z grafičnimi odvisnostmi preučujemo vpliv različnih zunanjih vplivov na encimski proces.

Ta veja encimologije preučuje vpliv različnih dejavnikov na hitrost encimske reakcije. Ob upoštevanju splošne enačbe za encimsko katalizo reverzibilne reakcije pretvorbe enega substrata v en produkt (1),

Poimenovati je treba glavne dejavnike, ki vplivajo na hitrost encimske reakcije: koncentracija substrata [S], koncentracija encima [E] in koncentracija reakcijskega produkta [P].

Interakcija nekaterih encimov z njihovim substratom je lahko opisana s hiperbolično krivuljo odvisnosti hitrosti encimske reakcije V od koncentracije substrata [S] (slika 19):

Sl. 19. Odvisnost hitrosti encimske reakcije od koncentracije substrata.

Na tej krivulji je mogoče razlikovati tri odseke, ki jih je mogoče razložiti z določbami mehanizma interakcije encima s substratom: OA - odsek neposredno sorazmerne odvisnosti V od [S], aktivni centri encima se postopoma napolnijo z molekulami substrata s tvorbo nestabilnega kompleksa ES; odsek AB - krivuljasta odvisnost V od [S], popolna nasičenost aktivnih centrov encima s substratnimi molekulami še ni dosežena. Kompleks ES je nestabilen, preden doseže prehodno stanje; verjetnost povratne disociacije na E in S je še vedno visoka; presek BC - odvisnost opisuje enačba ničelnega reda, presek je vzporeden z osjo [S], dosežena popolna nasičenost aktivnih encimov s substratnimi molekulami, V=V max.

Značilno obliko krivulje matematično opisuje Briggs-Haldanova enačba:

V=V max ● [S]/ Km + [S] (2),

kjer je Km Michaelis-Mentenova konstanta, numerično enaka koncentraciji substrata, pri kateri je hitrost encimske reakcije enaka polovici V max.

Nižji kot je K m encima, večja je afiniteta encima do substrata, hitreje je doseženo prehodno stanje za substrat in se spremeni v reakcijski produkt. Iskanje vrednosti Km za vsak skupinsko specifičen encimski substrat je pomembno pri določanju biološke vloge tega encima v celici.

Za večino encimov je nemogoče zgraditi hiperbolično krivuljo (slika 19), v tem primeru se uporablja metoda dvojnih recipročnih vrednosti (Lineweaver-Burk), t.j. je prikazana grafična odvisnost 1/[V] od 1/[S] (slika 20). Metoda izdelave takšnih krivulj v eksperimentu je zelo priročna pri preučevanju vpliva različnih vrst inhibitorjev na aktivnost encimov (glej nadaljevanje v besedilu).

Slika 20. Graf 1/[V] proti 1/[S] (metoda Lineweaver-Burk),

kjer je y mejni odsek - , x pa mejni odsek - , tangens kota α - .

Odvisnost hitrosti encimske reakcije V od koncentracije encima [E].

Ta grafična odvisnost (slika 21) je upoštevana pri optimalni temperaturi in pH okolja, pri koncentracijah substrata, ki so znatno višje od koncentracije nasičenja aktivnih centrov encima.

riž. 21. Vpliv koncentracije encima na hitrost encimske reakcije.

Odvisnost hitrosti encimske reakcije od koncentracije kofaktorja ali koencima. Pri kompleksnih encimih je treba upoštevati, da pomanjkanje koencimskih oblik vitaminov v primeru hipovitaminoze in kršitev vnosa kovinskih ionov v telo nujno vodi do zmanjšanja koncentracije ustreznih encimov, potrebnih za potek presnovnih procesov. Zato je treba sklepati, da je aktivnost encima neposredno odvisna od koncentracije kofaktorja ali koencima.

Vpliv koncentracije produkta na hitrost encimske reakcije. Pri reverzibilnih reakcijah, ki potekajo v človeškem telesu, je treba upoštevati, da lahko produkte neposredne reakcije encim uporabi kot substrat za povratno reakcijo. Zato sta smer toka in trenutek doseganja Vmax odvisna od razmerja koncentracij začetnih substratov in reakcijskih produktov. Na primer, aktivnost alanin aminotransferaze, ki katalizira transformacijo:

Alanin + alfa-ketoglutarat ↔ piruvat + glutamat

odvisno v celici od koncentracijskega razmerja:

[alanin + alfa-ketoglutarat] / [piruvat + glutamat].

MEHANIZEM DELOVANJA ENCIMA. TEORIJE ENCIMSKE KATALIZE

Encimi, tako kot neproteinski katalizatorji, povečajo hitrost kemijske reakcije zaradi svoje sposobnosti zmanjšanja aktivacijske energije te reakcije. Aktivacijska energija encimske reakcije se izračuna kot razlika med vrednostjo energije v sistemu potekajoče reakcije, ki je dosegla prehodno stanje, in energijo, določeno na začetku reakcije (glej grafično odvisnost na sliki 22).

riž. 22. Grafična odvisnost energijskega stanja kemijske reakcije brez encima (1) in v prisotnosti encima (2) od reakcijskega časa.

Delo V. Henryja in zlasti L. Michaelisa, M. Mentena pri preučevanju mehanizma monosubstratnih reverzibilnih encimskih reakcij je omogočilo domnevo, da se encim E najprej reverzibilno in razmeroma hitro poveže s svojim substratom S, da tvori encim- substratni kompleks (ES):

E+S<=>ES (1)

Tvorba ES nastane zaradi vodikovih vezi, elektrostatičnih, hidrofobnih interakcij, v nekaterih primerih kovalentnih, koordinacijskih vezi med stranskimi radikali aminokislinskih ostankov aktivnega centra in funkcionalnimi skupinami substrata. Pri kompleksnih encimih lahko funkcijo stika s substratom opravlja tudi neproteinski del strukture.

Kompleks encim-substrat nato razpade v drugi, počasnejši, reverzibilni reakciji, da nastane reakcijski produkt P in prosti encim E:

ES<=>EP<=>E+P (2)

Trenutno, zahvaljujoč delu zgoraj omenjenih znanstvenikov, pa tudi Keilin D., Chance B., Koshland D. (teorija "inducirane korespondence"), obstajajo teoretične določbe o štirih glavnih točkah mehanizma delovanja. encima na substratu, ki določajo sposobnost encimov za pospeševanje kemičnih reakcij:

1. Usmerjenost in pristop . Encim je sposoben vezati substratno molekulo tako, da se vez, ki jo napade encim, ne le nahaja v neposredni bližini katalitične skupine, temveč je tudi pravilno usmerjena glede nanjo. Močno se poveča verjetnost, da bo kompleks ES dosegel prehodno stanje z orientacijo in bližino.

2. Stres in napetost : inducirana korespondenca. Pritrditev substrata lahko povzroči konformacijske spremembe v encimski molekuli, ki vodijo do napetosti v strukturi aktivnega centra, in tudi nekoliko deformira vezan substrat, s čimer olajša doseganje prehodnega stanja kompleksa ES. Med molekulama E in S nastane tako imenovana inducirana korespondenca.

Hitrost encimskih reakcij je odvisna od koncentracije encima, substrata, temperature, pH ter prisotnosti aktivatorjev in inhibitorjev.

V pogojih presežka substrata hitrost reakcije neposredno sorazmerna koncentracija encima (slika 3.2).

riž. 3.2. Odvisnost hitrosti reakcije od koncentracije encima.

Odvisnost hitrosti reakcije od koncentracija substrata prikazano na sliki 3.3.

riž. 3.3. Odvisnost hitrosti reakcije od koncentracije substrata.

Na grafu so 3 deli. Pri nizki koncentraciji substrata (oddelek A) hitrost reakcije je neposredno sorazmerna s koncentracijo substrata in upošteva kinetiko prvega reda. Lokacija vklopljena b(reakcija mešanega reda) je ta odvisnost porušena. Lokacija vklopljena c hitrost reakcije je največja in ni odvisna od koncentracije substrata.

Za encimsko reakcijo je značilna tvorba kompleksa encim-substrat, ki razpade, da nastane prosti encim in produkt reakcije.

V tej enačbi je k 1 konstanta hitrosti za tvorbo kompleksa encim-substrat, k 2 je konstanta disociacije kompleksa encim-substrat, da nastane prosti encim in substrat, in k 3 je konstanta hitrosti za disociacijo kompleksa encim-substrat v prosti encim in produkt reakcije.

Michaelis in Menten sta predlagala enačbo, ki opisuje odvisnost hitrosti reakcije od koncentracije substrata.

v hitrost reakcije pri dani koncentraciji substrata; Ks – disociacijska konstanta kompleksa encim-substrat; Vmax – največja hitrost reakcije.

Ks=k -2 /k 1 tj. razmerje med konstanto povratne reakcije in konstanto neposredne reakcije.

Vendar ta enačba opisuje samo odsek A na grafu in ne upošteva vpliva reakcijskih produktov na hitrost encimskega procesa.

Haldane in Briggs sta disociacijsko konstanto v enačbi nadomestila z Michaelisovo konstanto (Km).

Michaelisova konstantaštevilčno enaka koncentraciji substrata, pri kateri je hitrost reakcije polovica največje. Michaelisova konstanta označuje afiniteto encima in substrata. Za visoko afiniteto encima do substrata je značilna nizka vrednost Km in obratno.

Uporaba grafa, ki sta ga predlagala Michaelis in Menten, je neprijetna. Za bolj priročno grafično predstavitev sta G. Lineweaver in D. Burke preoblikovala Haldaneovo in Briggsovo enačbo z uporabo metode dvojnih recipročnih vrednosti, ki temelji na načelu, da če obstaja enakost med dvema količinama, bosta tudi recipročni vrednosti enaki.

Grafični prikaz odvisnosti hitrosti reakcije od pH ima obliko zvona. Vrednost pH, pri kateri ima encim največjo aktivnost, se imenuje optimalen pH(Slika 5.4 A) . Za večino encimov je optimalni pH 6-8. Izjema je pepsin, katerega optimum je 2,0. Ko se pH spremeni v eno ali drugo smer od optimalnega, se hitrost reakcije zmanjša zaradi ionizacije funkcionalnih skupin encima in substrata, kar moti tvorbo kompleksa encim-substrat.

riž. 3.4. Odvisnost hitrosti reakcije od pH (A) in temperature (B).

Hitrost kemične reakcije se z naraščanjem poveča za 2-krat temperaturo za 10°C. Zaradi beljakovinske narave encima pa z nadaljnjim zviševanjem temperature pride do denaturacije encima. Imenuje se temperatura, pri kateri je hitrost reakcije največja temperaturni optimum(slika 3.4. B) . Za večino encimov je optimalna temperatura 37-40°C. Izjema je mišična miokinaza, ki prenese segrevanje do 100°C.

Aktivatorji encimov– to so snovi 1), ki tvorijo aktivno središče encima (Co 2+, Mg 2+, Zn 2+, Fe 2+, Ca 2+); 2) olajšanje tvorbe kompleksa encim-substrat (Mg 2+); 3) reducirajoče SH skupine (glutation, cistein, merkaptoetanol); 4) stabilizacija naravne strukture beljakovinskega encima. Encimske reakcije običajno aktivirajo kationi (v periodnem sistemu od 19 do 30). Anioni so manj aktivni, čeprav lahko klorovi ioni in anioni nekaterih drugih halogenov aktivirajo pepsin, amilazo in adenilat ciklazo. Proteini so lahko aktivatorji: apoprotein A-I (LCAT), apoprotein C-II (LPL).

Mehanizem delovanja aktivatorjev:

1) sodelujejo pri tvorbi aktivnega centra encimov;

2) olajšati vezavo substrata in encima;

3) sodelujejo pri tvorbi naravne strukture encima.

Zaviralci– snovi, ki povzročajo delno ali popolno inhibicijo reakcij, ki jih katalizirajo encimi.

Inhibitorje delimo na nespecifična in specifična. Delovanje nespecifičnih inhibitorjev ni povezano z mehanizmom delovanja encimov. Ti zaviralci povzročijo denaturacijo encimskega proteina (toplota, kisline, alkalije, soli težkih kovin itd.).

Specifični inhibitorji vplivajo na mehanizem delovanja encimov. Specifični zaviralci so razdeljeni v 2 skupini: reverzibilno in ireverzibilno. Ireverzibilni inhibitorji povzročijo trajno, ireverzibilno spremembo ali modifikacijo funkcionalnih skupin encima s tesno ali kovalentno vezavo. Ta skupina vključuje: 1) zaviralci kovin encimi (HCN, RCN, HF, CO itd.). Te spojine se vežejo na kovine s spremenljivo valenco (Cu ali Fe), zaradi česar je moten proces prenosa elektronov vzdolž dihalne verige encimov. Zato se ti zaviralci imenujejo respiratorni strupi. 2) zaviralci encimov, ki vsebujejo skupine SH(monoidoacetat, dijodoacetat, jodoacetamid, spojine arzena in živega srebra). 3) zaviralci encimov, ki vsebujejo OH skupino v aktivnem središču (organofosforne spojine, insekticidi). Ti zaviralci zavirajo predvsem aktivnost holinesteraze, encima, ki ima primarno vlogo pri delovanju živčnega sistema.

Reverzibilen inhibicijo lahko kvantificiramo z uporabo Michaelis-Mentenove enačbe. Reverzibilne inhibitorje delimo na tekmovalne in nekonkurenčne.

Konkurenčni inhibitorji- To so snovi, ki so po strukturi podobne substratu. Inhibitor se veže na aktivno mesto encima in prepreči nastanek encimsko-substratnega kompleksa.

Klasičen primer kompetitivne inhibicije je inhibicija sukcinat dehidrogenaze z malonsko kislino. Sukcinat dehidrogenaza katalizira oksidacijo jantarne kisline (sukcinata) z dehidrogenacijo v fumarno kislino.

Če mediju dodamo malonsko kislino (inhibitor), potem bo zaradi svoje strukturne podobnosti s pravim substratnim sukcinatom reagirala z aktivnim mestom in tvorila kompleks encim-inhibitor, vendar do reakcije ne bo prišlo.

Učinek inhibitorja se odpravi z povečanje koncentracije substrata. S kompetitivno inhibicijo se spremeni kinetika encimskih reakcij: Km se poveča, V max ostane konstanten(slika 3.5).

riž. 3.5. Vpliv kompetitivnih inhibitorjev na hitrost encimske reakcije

Metoda konkurenčne inhibicije je našla uporabo v medicinski praksi kot antimetaboliti.

Na primer, sulfonamidna zdravila se uporabljajo za zdravljenje nekaterih nalezljivih bolezni, ki jih povzročajo bakterije. Ta zdravila so strukturno podobna para-aminobenzojski kislini, ki jo bakterijska celica uporablja za sintezo folne kisline, ki je potrebna za življenje bakterij. Zaradi te strukturne podobnosti sulfonamid blokira delovanje encima tako, da izpodriva para-aminobenzojsko kislino iz kompleksa z encimom, ki sintetizira folno kislino.

Nekonkurenčni zaviralci – snovi, ki po strukturi niso podobne substratom. Nekompetitivni inhibitorji se ne vežejo na aktivno mesto, ampak na drugo mesto v molekuli encima, na primer v alosteričnem središču. S tem se spremeni konformacija aktivnega centra na način, da je interakcija substrata z njim motena.

Za nekonkurenčno zaviranje: V max se zmanjša, K m pa se ne spremeni(slika 3.6).