Kinetika enzimskih reakcija. Ovisnost brzine enzimskih reakcija od koncentracije supstrata, enzima, temperature Koji je redoslijed enzimske reakcije po enzimu
Brzina enzimskih reakcija ovisi o koncentraciji sub-
strat. Ova zavisnost je kompleksna, koja se za određene enzime opisuje paraboličnom krivom (slika 29).
Slika 29 – Zavisnost brzine enzimske reakcije
na koncentraciju supstrata
Parabolična priroda zavisnosti objašnjava se činjenicom da kada enzim stupi u interakciju sa supstratom, nastaje kompleks enzim-supstrat. U početku, kako se koncentracija supstrata povećava, koncentracija enzim-supstrat kompleksa u reakcionoj smjesi raste, što se manifestira paralelnim povećanjem brzine reakcije. Pri određenoj koncentraciji supstrata (zasićenje) dolazi do svojevrsnog „zasićenja“ svih aktivnih centara molekula enzima u reakcijskoj smjesi. Brzina enzimske reakcije pri koncentraciji zasićenja postaje maksimalna. Daljnjim povećanjem sadržaja supstrata u reakcijskoj smjesi, on se ne mijenja.
Iz grafikona ovisnosti brzine enzimske reakcije od koncentracije supstrata izračunavaju se dva važna pokazatelja:
1. Maksimalna brzina reakcije (V max). Definira se kao brzina reakcije pri koncentraciji zasićenja supstrata. Maksimalna vrijednost brzine odražava katalitičku snagu enzima. Veći enzimi V max su snažniji katalizatori. Po jedinici vremena katalizuju transformaciju više molekule supstrata. Maksimalna brzina se izražava brojem obrtaja enzima. Broj obrta se procjenjuje brojem molekula supstrata koje enzim pretvara u jedinici vremena (s -1). Za većinu enzima, broj obrtaja je unutar 10 4. Istovremeno, postoje enzimi za koje brzina značajno više (600.000 za karbanhidrazu) ili manje od ove vrijednosti (100 za himotripsin).
2. Michaelisova konstanta (TO m). Michaelisova konstanta je koncentracija supstrata pri kojoj je brzina reakcije upola maksimalna. Magnituda TO m odražava afinitet enzima prema supstratu. Što je ova vrijednost veća, enzim ima manji afinitet za supstrat. TO m se izražava u molovima supstrata. Dakle, vrijednost TO m u odnosu na glukozu za enzim glukokinazu je 10 mmol, a za heksokinazu - 0,01 mmol. Heksokinaza pokazuje veći afinitet za glukozu od glukokinaze pri istoj koncentraciji supstrata, katalizuje fosforilaciju glukoze većom brzinom.
Na osnovu matematička analiza krivulja zavisnosti brzine enzimske reakcije od koncentracije supstrata, L. Michaelis i M. Menten (1913) su izveli formulu koja omogućava da se procijeni odnos između brzine reakcije, maksimalne brzine i Michaelisove konstante . Trenutno je definirana kao Michaelis–Menten jednačina.
V o = V max [ S]/K m + [ S],
Gdje V o – brzina reakcije, S– koncentracija supstrata.
Opća svojstva enzima
Unatoč postojanju određenih razlika u strukturi, funkciji i unutarćelijskoj lokalizaciji, enzime karakterizira niz zajedničkih svojstava. To uključuje ovisnost manifestacije njihove katalitičke aktivnosti o temperaturi (termalna labilnost) i pH okoline, kao i specifičnosti supstrata.
Karakteristično svojstvo enzima je termolabilnost. Ovaj fenomen se može ilustrirati grafikom brzine enzimske reakcije u odnosu na temperaturu reakcione smjese (slika 30).
Slika 30 – Zavisnost brzine enzimske reakcije od temperature
reakcijski medij ( t opt – optimalna temperatura; V- brza reakcija)
Kao što se može vidjeti iz prikazanog grafikona, na temperaturi blizu 4 o C, enzimske reakcije praktično ne nastaju. Iz tog razloga, biološki objekti se mogu čuvati na hladnom određeno vrijeme prije izvođenja biohemijskih studija. Hladnoća je ta koja omogućava da se prehrambeni proizvodi sačuvaju od autolize (samoprobave).
Povećanje temperature je praćeno povećanjem brzine enzimske reakcije. Razlog tome je povećanje kinetičke energije molekula supstrata i enzima, što povećava brzinu interakcije između njih. Sličan fenomen se opaža do temperature koja odgovara temperaturnom optimumu enzima. Temperaturni optimum enzima odgovara temperaturi na kojoj je brzina enzimske reakcije maksimalna. Za enzime toplokrvnih životinja obično je 28 o C ili 37 o C.
Dalje povećanje temperature reakcione smjese dovodi do postepenog smanjenja brzine enzimske reakcije. Ovaj fenomen je posljedica procesa termičke denaturacije proteinskog polipeptidnog lanca. Denaturacija je praćena promjenom strukture aktivnog centra enzima, što rezultira smanjenjem afiniteta enzima za supstrat. Na temperaturama iznad 55 o C većina enzima potpuno gubi svoja katalitička svojstva (inaktivira se). S tim u vezi, zagrijavanje na 55–56 o C se široko koristi za postupak pasterizacije, čime se produžava rok trajanja prehrambenih proizvoda (mlijeko, itd.).
pH okoline ima veliki uticaj na brzinu enzimske reakcije. Kao što se može vidjeti iz prikazane slike. 31, oblikom podsjeća na graf ovisnosti brzine enzimske reakcije od temperature.
Slika 31 – Ovisnost o brzini ( V) enzimska reakcija
na pH okoline (pH opt – pH optimum enzima)
Oštar pad brzine enzimske reakcije pri ekstremnim pH vrijednostima povezan je s fenomenom denaturacije polipeptidnog lanca proteinske molekule pod utjecajem kiselina i lužina. Enzim pokazuje maksimalnu katalitičku moć pri pH vrijednosti, koja je određena terminom pH optimalan enzim. Većina poznatih enzima ima optimalni pH u rasponu od 5,0 do 7,5. Istovremeno, postoji mnogo primjera enzima kod kojih je pH optimalna vrijednost pomjerena u područje kiselih ili alkalnih pH vrijednosti. Ovi enzimi uključuju:
Razlog postojanja zavisnosti brzine enzimskih reakcija o pH je činjenica da pH vrednost medijuma ima izražen uticaj na stepen jonizacije funkcionalnih grupa supstrata. Karakteristike ionizacije molekula jantarne kiseline pri različitoj kiselosti okoline (pH):
Istovremeno, pH okoline utiče i na stepen jonizacije radikala aminokiselina koji čine aktivni centar enzima:
Ako se formiranje kompleksa enzim-supstrat stabilizuje usled elektrostatičkih interakcija, onda postaje jasna uloga pH u obezbeđivanju optimalnih uslova za tok enzimske reakcije (slika 24).
Brzina reakcija koje kataliziraju enzimi, u čijoj interakciji sa supstratima elektrostatičke interakcije nisu značajne, u manjoj mjeri ovisi o pH vrijednosti medija. Na sl. Slika 32 prikazuje zavisnost brzine hidrolize proteina papainom. U interakciji ovog enzima sa supstratom, hidrofobne interakcije postaju od primarnog značaja. Kao što se može vidjeti iz prikazanog grafikona, papain općenito nema jasno definiran pH optimum.
Slika 32 - Uticaj pH na brzinu hidrolize proteina papainom.
Enzimi imaju određene specifičnost u vezi sa podlogama. Specifičnost se odnosi na sposobnost enzima da kataliziraju transformaciju jednog ili grupe strukturno sličnih supstrata. Postoji nekoliko tipova specifičnosti enzima.
· Apsolutna specifičnost. Odnosi se na sposobnost enzima da katalizira transformaciju samo jednog supstrata. Enzimi sa apsolutnom specifičnošću uključuju arginazu, restrikcijske enzime urikaze itd.
· Relativna specifičnost. To znači sposobnost enzima da katalizira transformaciju grupe supstrata slične strukture (tzv. proteolitički enzimi hidroliziraju različite proteine, lipazu estri glicerol i više masne kiseline, heksokinaza fosforilira različite monosaharide). U ovom slučaju, specifičnost je određena činjenicom da enzim utiče samo na određenu vrstu veze (proteolitički enzimi hidroliziraju peptidnu vezu, lipaza hidrolizuje estersku vezu, itd.).
· Stereospecifičnost . Ovaj termin se odnosi na sposobnost enzima da katalizira konverziju jednog stereoizomera supstrata. Dakle, enzimi uključeni u konverziju monosaharida pokazuju specifičnost u odnosu na njihovu D-stereoizomeri, i enzimi uključeni u transformaciju aminokiselina - u njihove L-stereo-izomeri.
Aktivnost enzima
Posebnost enzima kao katalizatora je u tome što su sposobni mijenjati svoja katalitička svojstva pod utjecajem različitih vanjskih faktora. Mjera za snagu katalitičkog djelovanja enzima je njihova aktivnost. Sposobnost enzima da mijenjaju svoju aktivnost u različitim uvjetima ima veliki biološki smisao. Ovo svojstvo omogućava živoj ćeliji da prilagodi stanje metaboličkih procesa neposrednim potrebama ćelija, koje se mogu značajno promeniti pod uticajem različitih spoljašnjih faktora.
Određivanje aktivnosti enzima igra važnu ulogu u njihovoj karakterizaciji. Postoje neki opći principi za kvantificiranje aktivnosti enzima. Aktivnost enzima se može odrediti na sljedeći način:
• bilo brzinom akumulacije u reakcionoj smjesi gdje se nalazi enzim produkta reakcije;
• ili brzinom nestajanja supstrata enzimske reakcije iz reakcione smjese.
Oba ova pristupa su ekvivalentna i mogu se koristiti u praksi. Međutim, pri određivanju aktivnosti enzima moraju se poštovati sljedeći uslovi: u reakcionoj smjesi u kojoj se utvrđuje aktivnost enzima,
· temperatura mora odgovarati temperaturnom optimumu enzima;
· pH medijuma mora odgovarati pH optimumu ovog enzima;
· koncentracija supstrata ne smije biti manja od zasićenja;
· moraju biti prisutni kofaktori, ako ih ovaj enzim ima;
Aktivatori enzima moraju biti prisutni.
Dakle, aktivnost enzima se određuje u optimalnim uslovima. Pod ovim uslovima, aktivnost enzima je proporcionalna njegovom sadržaju u ispitivanom uzorku i stoga se može koristiti za indirektnu procenu njegove koncentracije.
Aktivnost enzima je kvantitativno izražena u jedinice aktivnosti. Jedna jedinica enzimske aktivnosti (U) je aktivnost enzima pri kojoj se pod njegovim utjecajem formira 1 µmol produkta reakcije (ili nestaje 1 µmol supstrata) u minuti. U SI sistemu jedinica enzimske aktivnosti je katal (kat). 1 katal odgovara enzimskoj aktivnosti u kojoj se formira jedan mol produkta reakcije (jedan mol supstrata nestaje) u sekundi.
Specifična vrijednost aktivnosti se također koristi za karakterizaciju enzima. Ova jedinica odražava aktivnost enzima po jedinici mase i izražava se u µmol/min mg proteina. Jedinice specifične aktivnosti koriste se za procjenu čistoće enzimskih preparata. Što je veća specifična aktivnost, to je enzimski preparat čišći.
Kinetika enzima proučava uticaj različitih faktora (koncentracija S i E, pH, temperatura, pritisak, inhibitori i aktivatori) na brzinu enzimskih reakcija. Glavni cilj proučavanja kinetike enzimskih reakcija je dobivanje informacija koje omogućavaju dublje razumijevanje mehanizma djelovanja enzima.
Kinetička kriva omogućava vam da odredite početnu brzinu reakcije V 0 .
Kriva zasićenja podloge.
Ovisnost brzine reakcije o koncentraciji enzima.
Ovisnost brzine reakcije o temperaturi.
Ovisnost brzine reakcije o pH.
|
|
Optimalni pH za djelovanje većine enzima je u fiziološkom rasponu od 6,0-8,0. Pepsin je aktivan na pH 1,5-2,0, što odgovara kiselosti želudačnog soka. Arginaza, enzim specifičan za jetru, aktivan je na 10,0. Uticaj pH na brzinu enzimske reakcije povezan je sa stanjem i stepenom jonizacije ionogenih grupa u molekulima enzima i supstrata. Ovaj faktor određuje konformaciju proteina, stanje aktivnog centra i supstrata, formiranje kompleksa enzim-supstrat i sam proces katalize. |
Matematički opis krivulje zasićenja supstrata, Michaelisova konstanta .
|
|
Jednačinu koja opisuje krivulju zasićenja supstrata predložili su Michaelis i Menton i nosi njihova imena (Michaelis-Menten jednadžba): V = (V MAX *[ S])/(Km+[ S]) , gdje je Km Michaelisova konstanta. Lako je izračunati da je pri V = V MAX /2 Km = [S], tj. Km je koncentracija supstrata pri kojoj je brzina reakcije ½ V MAX. Da bi se pojednostavilo određivanje V MAX i Km, Michaelis-Menten jednadžba se može ponovo izračunati. 1/V = (Km+[S])/(V MAX *[S]), 1/V = Km/(V MAX *[S]) + 1/V MAX , |
|
|
1/ V = Km/ V MAX *1/[ S] + 1/ V MAX Lineweaver-Burk jednadžba. Jednačina koja opisuje Lineweaver-Burk grafikon je jednačina prave linije (y = mx + c), gdje je 1/V MAX presjek prave linije na y-osi; Km/V MAX - tangenta ugla nagiba prave linije; presek prave linije sa apscisnom osom daje vrednost 1/Km. Lineweaver-Burk dijagram omogućava vam da odredite km iz relativno malog broja tačaka. Ovaj grafikon se također koristi kada se procjenjuje učinak inhibitora, o čemu će biti riječi u nastavku. Vrijednost Km varira u velikoj mjeri: od 10 -6 mol/l za vrlo aktivne enzime, do 10 -2 za nisko aktivne enzime. |
Procjene u kilometrima imaju praktičnu vrijednost. Pri koncentracijama supstrata 100 puta većim od Km, enzim će raditi skoro maksimalnom brzinom, tako da će maksimalna brzina V MAX odražavati količinu prisutnog aktivnog enzima. Ova se okolnost koristi za procjenu sadržaja enzima u preparatu. Osim toga, Km je karakteristika enzima koji se koristi za dijagnosticiranje enzimopatija.
Inhibicija aktivnosti enzima.
Izuzetno karakteristična i važna karakteristika enzima je njihova inaktivacija pod uticajem određenih inhibitora.
Inhibitori - to su tvari koje uzrokuju djelomičnu ili potpunu inhibiciju reakcija kataliziranih enzimima.
Inhibicija enzimske aktivnosti može biti ireverzibilna ili reverzibilna, kompetitivna ili nekonkurentna.
Nepovratna inhibicija - ovo je trajna inaktivacija enzima, koja je rezultat kovalentnog vezivanja molekula inhibitora na aktivnom mjestu ili u drugom posebnom centru koji mijenja konformaciju enzima. Disocijacija takvih stabilnih kompleksa sa regeneracijom slobodnog enzima je praktično isključena. Da bi se prevladale posljedice takve inhibicije, tijelo mora sintetizirati nove molekule enzima.
Reverzibilna inhibicija – karakterizira ravnotežno kompleksiranje inhibitora sa enzimom zbog nekovalentnih veza, zbog čega su takvi kompleksi sposobni za disocijaciju uz obnavljanje aktivnosti enzima.
Klasifikacija inhibitora na kompetitivne i nekonkurentne zasniva se na tome da li je oslabljen ( konkurentska inhibicija ) ili nije oslabljen ( nekonkurentna inhibicija ) njihov inhibitorni efekat kada se koncentracija supstrata povećava.
Kompetitivni inhibitori - to su po pravilu spojevi čija je struktura slična strukturi supstrata. To im omogućava da se vežu na istom aktivnom mjestu kao i supstrati, sprječavajući enzim da stupi u interakciju sa supstratom već u fazi vezivanja. Nakon vezivanja, inhibitor se može pretvoriti u proizvod ili ostati na aktivnom mjestu dok ne dođe do disocijacije.
Reverzibilna kompetitivna inhibicija može se predstaviti kao dijagram:
E↔ E-I → E + P 1
S (neaktivan)
Stepen inhibicije enzima određen je odnosom koncentracija supstrata i enzima.
Klasičan primjer ove vrste inhibicije je inhibicija aktivnosti sukcinat dehidrogenaze (SDH) malatom, koji istiskuje sukcinat sa mjesta supstrata i sprječava njegovu konverziju u fumarat:
Kovalentno vezivanje inhibitora na aktivno mesto dovodi do inaktivacije enzima (ireverzibilne inhibicije). Primjer nepovratna kompetitivna inhibicija može poslužiti kao inaktivacija triosefosfat izomeraze sa 3-kloroacetol fosfatom. Ovaj inhibitor je strukturni analog supstrata, dihidroksiaceton fosfata, i nepovratno se veže za ostatak glutaminske kiseline u aktivnom mjestu:
Neki inhibitori djeluju manje selektivno, u interakciji sa specifičnom funkcionalnom grupom u aktivnom centru različitih enzima. Dakle, vezivanje jodoacetata ili njegovog amida za SH grupu aminokiseline cisteina, koja se nalazi u aktivnom centru enzima i koja učestvuje u katalizi, dovodi do potpunog gubitka aktivnosti enzima:
R-SH + JCH 2 COOH → HJ + R-S-CH 2 COOH
Stoga ovi inhibitori inaktiviraju sve enzime koji imaju SH grupe uključene u katalizu.
Ireverzibilna inhibicija hidrolaza pod dejstvom nervnih gasova (sarin, soman) je posledica njihovog kovalentnog vezivanja za serinski ostatak u aktivnom centru.
Metoda kompetitivne inhibicije našla je široku primjenu u medicinskoj praksi. Sulfonamidni lijekovi, antagonisti p-aminobenzojeve kiseline, mogu poslužiti kao primjer metaboliziranih kompetitivnih inhibitora. Vežu se za dihidropterat sintetazu, bakterijski enzim koji pretvara p-aminobenzoat u folnu kiselinu, neophodnu za rast bakterija. Bakterija umire kao rezultat činjenice da se vezani sulfanilamid pretvara u drugo jedinjenje i ne nastaje folna kiselina.
Nekompetitivni inhibitori obično se vežu za molekul enzima na mjestu različitom od mjesta vezivanja supstrata, a supstrat se ne nadmeće direktno sa inhibitorom. Budući da se inhibitor i supstrat vezuju za različite centre, moguće je formiranje i E-I kompleksa i S-E-I kompleksa. Kompleks S-E-I se također razgrađuje kako bi nastao proizvod, ali sporije od E-S, tako da će se reakcija usporiti, ali ne i zaustaviti. Dakle, mogu se javiti sljedeće paralelne reakcije:
E↔ E-I ↔ S-E-I → E-I + P
Reverzibilna nekompetitivna inhibicija je relativno rijetka.
Nekompetitivni inhibitori se nazivaju alosterični za razliku od konkurentskih ( izosteričan ).
Reverzibilna inhibicija se može kvantitativno proučavati pomoću Michaelis-Menten jednačine.
Uz kompetitivnu inhibiciju, V MAX ostaje konstantan, a Km se povećava.
|
|
|
Uz nekonkurentnu inhibiciju, V MAX se smanjuje dok Km ostaje nepromijenjen.
|
|
|
Ako proizvod reakcije inhibira enzim koji katalizuje njegovo stvaranje, ova metoda inhibicije se naziva retroinhibicija ili inhibicija povratnih informacija . Na primjer, glukoza inhibira glukoza-6-fosfatazu, koja katalizira hidrolizu glukoza-6-fosfata.
Biološki značaj ove inhibicije je regulacija određenih metaboličkih puteva (vidi sljedeću lekciju).
PRAKTIČNI DIO
Zadatak za studente
1. Proučavati denaturaciju proteina pod uticajem rastvora mineralnih i organskih kiselina i pri zagrevanju.
2. Otkrijte koenzim NAD u kvascu.
3. Odrediti aktivnost amilaze u urinu (krvnom serumu).
9. STANDARDI ZA ODGOVORE NA PROBLEME, test pitanja koja se koriste za kontrolu znanja na času (mogu se koristiti kao dodatak)
10. PRIRODA I OBIM MOGUĆEG EDUKATIVNO-ISTRAŽIVAČKOG RADA NA TEMU
(Navedite posebno prirodu i oblik UIRS-a: priprema apstraktnih prezentacija, provođenje samostalnog istraživanja, simulacijske igre, priprema anamneze koristeći monografsku literaturu i druge oblike)
Kinetika enzima proučava brzinu reakcija koje kataliziraju enzimi u zavisnosti od različitih uslova (koncentracija, temperatura, pH, itd.) njihove interakcije sa supstratom.
Međutim, enzimi su proteini koji su osjetljivi na utjecaje različitih vanjskih utjecaja. Stoga se pri proučavanju brzine enzimskih reakcija uglavnom uzimaju u obzir koncentracije reagujućih supstanci, te nastoje da minimiziraju utjecaj temperature, pH okoline, aktivatora, inhibitora i drugih faktora i stvore standardne uslove. Prvo, ovo je pH vrijednost okoline koja je optimalna za dati enzim. Drugo, preporučuje se održavanje temperature od 25°C, gdje je to moguće. Treće, postiže se potpuna zasićenost enzima supstratom. Ova tačka je posebno važna jer pri niskim koncentracijama supstrata ne učestvuju svi molekuli enzima u reakciji (slika 6.5, A), što znači da će rezultat biti daleko od maksimalnog mogućeg. Najveća snaga katalizirane reakcije, pod jednakim uvjetima, postiže se ako svaki molekul enzima učestvuje u transformaciji, tj. pri visokim koncentracijama kompleksa enzim-supstrat (slika 6.5, V). Ako koncentracija supstrata ne osigurava potpunu zasićenost enzima (slika 6.5, b), tada brzina reakcije ne dostiže svoju maksimalnu vrijednost.
Rice. 65.
A - pri niskoj koncentraciji supstrata; 6 - sa nedovoljnom koncentracijom supstrata; V - kada je enzim potpuno zasićen supstratom
Brzina enzimske reakcije mjerena pod gore navedenim uvjetima i potpuna zasićenost enzima supstratom naziva se maksimalna brzina enzimske reakcije (V).
Brzina enzimske reakcije, određena kada enzim nije potpuno zasićen supstratom, označava se v.
Enzimska kataliza se može pojednostaviti sljedećim dijagramom:
gdje je F enzim; S - podloga; FS - kompleks enzim-supstrat.
Svaka faza ovog procesa karakterizira određena brzina. Jedinica mjere za brzinu enzimske reakcije je broj molova supstrata pretvorenih u jedinici vremena(isto kao i brzina normalne reakcije).
Interakcija enzima sa supstratom dovodi do stvaranja kompleksa enzim-supstrat, ali je taj proces reverzibilan. Brzine prednjih i reverznih reakcija zavise od koncentracija reaktanata i opisane su odgovarajućim jednadžbama:
U stanju ravnoteže, jednačina (6.3) je važeća, jer su brzine prednje i reverzne reakcije jednake.
Zamjenom vrijednosti brzine prednje (6.1) i obrnute (6.2) reakcije u jednadžbu (6.3) dobijamo jednakost:
Stanje ravnoteže karakteriše odgovarajuća konstanta ravnoteže K p, jednak omjeru konstanti prednje i reverzne reakcije (6.5). Recipročna vrijednost konstante ravnoteže se naziva konstanta supstrata Ks, ili konstanta disocijacije kompleksa enzim-supstrat:
Iz jednačine (6.6) jasno je da konstanta supstrata opada pri visokim koncentracijama kompleksa enzim-supstrat, tj. sa velikom stabilnošću. Posljedično, konstanta supstrata karakterizira afinitet enzima i supstrata i omjer konstanti brzine za formiranje i disocijaciju kompleksa enzim-supstrat.
Fenomen zasićenja enzima supstratom proučavali su Leonor Michaelis i Maud Mepten. Na osnovu matematičke obrade rezultata izveli su jednačinu (6.7) koja je dobila nazive, iz kojih je jasno da pri visokoj koncentraciji supstrata i niskoj vrijednosti konstante supstrata brzina enzimske reakcije teži maksimalnom . Međutim, ova jednadžba je ograničena jer ne uzima u obzir sve parametre:
Kompleks enzim-supstrat tokom reakcije može se transformisati u različitim smjerovima:
- disocirati u matične supstance;
- transformirati u proizvod iz kojeg se enzim odvaja nepromijenjen.
Stoga, da se opiše cjelokupno djelovanje enzimskog procesa, koncept Michaelisove konstante Kt, koji izražava odnos između konstanti brzine sve tri reakcije enzimske katalize (6.8). Ako se oba člana podijele sa konstantom brzine reakcije za formiranje kompleksa enzim-supstrat, dobićemo izraz (6.9):
Važan zaključak slijedi iz jednačine (6.9): Michaelisova konstanta je uvijek veća od konstante supstrata za iznos k 2 /k v
Brojčano K t jednak koncentraciji supstrata pri kojoj je brzina reakcije polovina najveće moguće brzine i odgovara zasićenju enzima supstratom, kao na sl. 6.5, b. Budući da u praksi nije uvijek moguće postići potpunu zasićenost enzima supstratom, upravo je K t se koristi za komparativne karakteristike kinetičke karakteristike enzima.
Brzina enzimske reakcije kada enzim nije potpuno zasićen supstratom (6.10) ovisi o koncentraciji kompleksa enzim-supstrat. Koeficijent proporcionalnosti je reakcijska konstanta za oslobađanje enzima i produkta, jer se time mijenja koncentracija kompleksa enzim-supstrat:
Nakon transformacija, uzimajući u obzir gore navedene zavisnosti, brzina enzimske reakcije kada enzim nije potpuno zasićen supstratom opisuje se jednadžbom (6.11), tj. zavisi od koncentracije enzima, supstrata i njihovog afiniteta K s:
Grafička ovisnost brzine enzimske reakcije o koncentraciji supstrata nije linearna. Kao što je očigledno iz Sl. 6.6, sa povećanjem koncentracije supstrata, uočava se povećanje aktivnosti enzima. Međutim, kada se postigne maksimalno zasićenje enzima supstratom, brzina enzimske reakcije postaje maksimalna. Stoga je faktor koji ograničava brzinu reakcije formiranje kompleksa enzim-supstrat.
Praksa je pokazala da se koncentracije supstrata, u pravilu, izražavaju u vrijednostima znatno manjim od jedinice (10 6 -10 3 mol). Prilično je teško raditi s takvim količinama u proračunima. Stoga su G. Lineweaver i D. Burke predložili da se grafička ovisnost brzine enzimske reakcije izrazi ne u direktnim koordinatama, već u inverznim. Polazili su od pretpostavke da su za jednake količine i njihovi inverzi jednaki:
Rice. 6.6.
Nakon transformacije izraza (6.13), dobijamo izraz tzv Lineweaver-Burk jednadžba (6.14):
Grafička zavisnost Lineweaver-Burk jednadžbe je linearna (slika 6.7). Kinetičke karakteristike enzima određuju se na sljedeći način:
- odsječeni segment na ordinatnoj osi je jednak 1/V;
- odsječeni segment na osi apscise jednak je -1 /To t.
Rice. 6.7.
Vjeruje se da metoda Lineweaver-Burk omogućuje preciznije određivanje maksimalne brzine reakcije nego u direktnim koordinatama. Vrijedne informacije o inhibiciji enzima također se mogu prikupiti iz ovog grafikona.
Postoje i drugi načini da se transformiše Michaelis-Menten jednačina. Grafičke zavisnosti se koriste za proučavanje uticaja različitih spoljašnjih uticaja na enzimski proces.
Ova grana enzimologije proučava uticaj različitih faktora na brzinu enzimske reakcije. Razmatrati opšta jednačina enzimska kataliza reverzibilne reakcije pretvaranja jednog supstrata u jedan proizvod (1),
Treba navesti glavne faktore koji utiču na brzinu enzimske reakcije: koncentracija supstrata [S], koncentracija enzima [E] i koncentracija produkta reakcije [P].
Interakcija nekih enzima sa njihovim supstratom može se opisati hiperboličkom krivuljom zavisnosti brzine enzimske reakcije V od koncentracije supstrata [S] (slika 19):
Slika 19. Zavisnost brzine enzimske reakcije od koncentracije supstrata.
Na ovoj krivulji mogu se razlikovati tri odsjeka, što se može objasniti odredbama mehanizma interakcije enzima sa supstratom: OA - dio direktno proporcionalne ovisnosti V od [S], aktivnih centara enzima postupno se pune molekulama supstrata uz formiranje nestabilnog kompleksa ES; sekcija AB - krivolinijska zavisnost V od [S], još nije postignuta potpuna zasićenost aktivnih centara enzima molekulima supstrata. ES kompleks je nestabilan prije nego što dostigne prijelazno stanje, vjerovatnoća obrnute disocijacije na E i S je još uvijek velika; presek BC - zavisnost je opisana jednačinom nultog reda, presek je paralelan sa [S] osom, postignuta je potpuna zasićenost aktivnih enzima molekulima supstrata, V=V max.
Karakterističan oblik krivulje je matematički opisan Briggs-Haldaneovom jednadžbom:
V=V max ● [S]/ Km + [S] (2),
gdje je Km Michaelis-Menten konstanta, numerički jednaka koncentraciji supstrata pri kojoj je brzina enzimske reakcije jednaka polovini V max.
Što je niži Km enzima, to je veći afinitet enzima za supstrat, brže se postiže prijelazno stanje za supstrat i pretvara se u produkt reakcije. Pronalaženje Km vrijednosti za svaki enzimski supstrat sa specifičnošću grupe je važno u određivanju biološka uloga ovog enzima u ćeliji.
Za većinu enzima je nemoguće konstruisati hiperboličku krivu (slika 19.) U ovom slučaju se koristi metoda dvostrukih recipročnih (Lineweaver-Burk), tj. grafička je zavisnost 1/[V] od 1/[S] (slika 20). Metoda konstruisanja ovakvih krivulja u eksperimentu je veoma pogodna za proučavanje uticaja razne vrste inhibitori aktivnosti enzima (videti tekst ispod).
Fig.20. Grafikon 1/[V] naspram 1/[S] (Lineweaver-Burk metoda),
gdje je y presek - , a x je presek - 
, tangent ugla α - .
Ovisnost brzine enzimske reakcije V o koncentraciji enzima [E].
Ova grafička zavisnost (slika 21) razmatra se pri optimalnoj temperaturi i pH okruženje, pri koncentracijama supstrata značajno većim od koncentracije zasićenja aktivnih mjesta enzima.
Rice. 21. Utjecaj koncentracije enzima na brzinu enzimske reakcije.
Ovisnost brzine enzimske reakcije o koncentraciji kofaktora ili koenzima. Za složene enzime treba uzeti u obzir da nedostatak koenzimskih oblika vitamina u slučaju hipovitaminoze i kršenje unosa metalnih iona u tijelo nužno dovode do smanjenja koncentracije odgovarajućih enzima potrebnih za tečaj. metaboličkih procesa. Stoga treba zaključiti da je aktivnost enzima direktno ovisna o koncentraciji kofaktora ili koenzima.
Utjecaj koncentracije proizvoda na brzinu enzimske reakcije. Za reverzibilne reakcije koje se dešavaju u ljudskom tijelu, mora se uzeti u obzir da proizvode direktne reakcije enzim može koristiti kao supstrate za reverznu reakciju. Stoga smjer strujanja i trenutak postizanja Vmax ovise o omjeru koncentracija početnih supstrata i produkta reakcije. Na primjer, aktivnost alanin aminotransferaze, koja katalizira transformaciju:
Alanin + Alfa-ketoglutarat ↔ Piruvat + Glutamat
ovisi u ćeliji o omjeru koncentracija:
[alanin + alfa-ketoglutarat] / [piruvat + glutamat].
MEHANIZAM DELOVANJA ENZIMA. TEORIJE ENZIMSKE KATALIZE
Enzimi, poput neproteinskih katalizatora, povećavaju brzinu hemijska reakcija zbog sposobnosti smanjenja energije aktivacije ove reakcije. Energija aktivacije enzimske reakcije izračunava se kao razlika između vrijednosti energije u sistemu tekuće reakcije koja je dostigla prelazno stanje i energije određene na početku reakcije (vidi grafičku zavisnost na slici 22).
Rice. 22. Grafička zavisnost energetskog stanja hemijske reakcije bez enzima (1) i u prisustvu enzima (2) o vremenu reakcije.
Rad V. Henryja i, posebno, L. Michaelis, M. Menten na proučavanju mehanizma monosupstrat reverzibilnih enzimskih reakcija omogućio je da se pretpostavi da se enzim E prvo reverzibilno i relativno brzo kombinuje sa svojim supstratom S kako bi formirao enzim- kompleks supstrata (ES):
E+S<=>ES (1)
Do stvaranja ES dolazi zbog vodikovih veza, elektrostatičkih, hidrofobnih interakcija, u nekim slučajevima kovalentnih, koordinacijskih veza između bočnih radikala aminokiselinskih ostataka aktivnog centra i funkcionalnih grupa supstrata. U kompleksnim enzimima funkciju kontakta sa supstratom može obavljati i neproteinski dio strukture.
Kompleks enzim-supstrat se zatim raspada u drugoj, sporijoj, reverzibilnoj reakciji da bi se proizveo produkt reakcije P i slobodni enzim E:
ES<=>EP<=>E+P (2)
Trenutno, zahvaljujući radu gore navedenih naučnika, kao i Keilin D., Chance B., Koshland D. (teorija „indukovane korespondencije“), postoje teorijske odredbe o četiri glavne tačke u mehanizmu delovanja enzima na supstratu, koji određuju sposobnost enzima da ubrzaju hemijske reakcije:
1. Orijentacija i pristup . Enzim je u stanju da veže molekul supstrata na takav način da veza koju enzim napada ne samo da se nalazi u neposrednoj blizini katalitičke grupe, već je i pravilno orijentisana u odnosu na nju. Vjerovatnoća da će ES kompleks doći u prijelazno stanje kroz orijentaciju i blizinu je znatno povećana.
2. Stres i naprezanje : indukovana korespondencija. Vezanje supstrata može izazvati konformacijske promjene u molekuli enzima, koje dovode do napetosti u strukturi aktivnog centra, a također donekle deformišu vezani supstrat, čime se olakšava postizanje prijelaznog stanja ES kompleksa. Između molekula E i S nastaje takozvana indukovana korespondencija.
Brzina enzimskih reakcija ovisi o koncentraciji enzima, supstratu, temperaturi, pH i prisutnosti aktivatora i inhibitora.
U uslovima viška supstrata, brzina reakcije direktno proporcionalno koncentracija enzima (Sl. 3.2).
Rice. 3.2. Ovisnost brzine reakcije o koncentraciji enzima.
Ovisnost brzine reakcije o koncentracija supstrata prikazano na slici 3.3.
Rice. 3.3. Ovisnost brzine reakcije o koncentraciji supstrata.
Postoje 3 sekcije na grafikonu. Pri niskoj koncentraciji supstrata (odjeljak A) brzina reakcije je direktno proporcionalna koncentraciji supstrata i poštuje kinetiku prvog reda. Lokacija uključena b(reakcija mješovitog reda) ova zavisnost je narušena. Lokacija uključena c brzina reakcije je maksimalna i ne ovisi o koncentraciji supstrata.
Enzimsku reakciju karakterizira stvaranje kompleksa enzim-supstrat, koji se razgrađuje i formira slobodni enzim i produkt reakcije.
U ovoj jednadžbi, k 1 je konstanta brzine za formiranje kompleksa enzim-supstrat, k 2 je konstanta disocijacije kompleksa enzim-supstrat za formiranje slobodnog enzima i supstrata, a k 3 je konstanta brzine za disocijaciju kompleksa enzim-supstrat u slobodni enzim i produkt reakcije.
Michaelis i Menten su predložili jednačinu koja opisuje ovisnost brzine reakcije o koncentraciji supstrata.
v je brzina reakcije pri datoj koncentraciji supstrata; Ks – konstanta disocijacije kompleksa enzim-supstrat; Vmax – maksimalna brzina reakcije.
Ks=k -2 /k 1 tj. omjer konstante reverzne reakcije i konstante naprijed reakcije.
kako god zadata jednačina opisuje samo područje A na grafikonu i ne uzima u obzir uticaj produkta reakcije na brzinu enzimskog procesa.
Haldane i Briggs su zamijenili konstantu disocijacije u jednačini Michaelisovom konstantom (Km).
Michaelisova konstanta brojčano jednaka koncentraciji supstrata, pri čemu je brzina reakcije upola manja. Michaelisova konstanta karakterizira afinitet enzima i supstrata. Visok afinitet enzima prema supstratu karakterizira niska vrijednost Km i obrnuto.
Korištenje grafa koji su predložili Michaelis i Menten je nezgodno. Za zgodnije grafički prikaz G. Lineweaver i D. Burke su transformisali Haldane-ovu i Briggsovu jednačinu metodom dvostrukih recipročnih vrijednosti, na osnovu principa da ako postoji jednakost između dvije veličine, onda će i recipročne vrijednosti biti jednake.
Grafički prikaz zavisnosti brzine reakcije od pH ima oblik zvona. Naziva se pH vrijednost pri kojoj enzim pokazuje maksimalnu aktivnost optimalni pH(Sl. 5.4 A) . Za većinu enzima, optimalni pH je 6-8. Izuzetak je pepsin, čiji je optimum 2,0. Kada se pH promijeni u jednom ili drugom smjeru od optimalnog, brzina reakcije se smanjuje zbog ionizacije funkcionalnih grupa enzima i supstrata, što remeti formiranje kompleksa enzim-supstrat.
Rice. 3.4. Ovisnost brzine reakcije o pH (A) i temperaturi (B).
Brzina hemijske reakcije se povećava za 2 puta temperatura za 10°C. Međutim, zbog proteinske prirode enzima, uz daljnje povećanje temperature dolazi do denaturacije enzima. Naziva se temperatura na kojoj je brzina reakcije maksimalna temperaturni optimum(Sl. 3.4. B) . Za većinu enzima, optimalna temperatura je 37-40°C. Izuzetak je mišićna miokinaza, koja može izdržati zagrijavanje do 100°C.
Aktivatori enzima– to su supstance 1) koje formiraju aktivni centar enzima (Co 2+, Mg 2+, Zn 2+, Fe 2+, Ca 2+); 2) olakšavanje formiranja kompleksa enzim-supstrat (Mg 2+); 3) redukcijske SH grupe (glutation, cistein, merkaptoetanol); 4) stabilizacija prirodne strukture proteina-enzima. Enzimske reakcije obično aktiviraju kationi (u periodnom sistemu od 19 do 30). Anioni su manje aktivni, iako joni klora i anioni nekih drugih halogena mogu aktivirati pepsin, amilazu i adenilat ciklazu. Proteini mogu biti aktivatori: apoprotein A-I (LCAT), apoprotein C-II (LPL).
Mehanizam djelovanja aktivatora:
1) učestvuje u formiranju aktivnog centra enzima;
2) olakšavaju vezivanje supstrata i enzima;
3) učestvuje u formiranju izvorna struktura enzim.
Inhibitori– tvari koje uzrokuju djelomičnu ili potpunu inhibiciju reakcija kataliziranih enzimima.
Inhibitori se dijele na nespecifičan I specifično. Djelovanje nespecifičnih inhibitora nije povezano s mehanizmom djelovanja enzima. Ovi inhibitori izazivaju denaturaciju enzima proteina (toplota, kiseline, baze, soli teških metala, itd.).
Specifični inhibitori utiču na mehanizam delovanja enzima. Specifični inhibitori se dijele u 2 grupe: reverzibilno i nepovratno. Ireverzibilni inhibitori uzrokuju trajnu, ireverzibilnu promjenu ili modifikaciju funkcionalnih grupa enzima kroz čvrsto ili kovalentno vezivanje. Ova grupa uključuje: 1) inhibitori metala enzimi (HCN, RCN, HF, CO, itd.). Ova jedinjenja se vezuju za metale promenljive valencije (Cu ili Fe), usled čega se odvija proces prenosa elektrona duž respiratorni lanac enzimi. Stoga se ovi inhibitori nazivaju respiratorni otrovi. 2) inhibitori enzima koji sadrže SH grupe(monoidoacetat, dijodoacetat, jodoacetamid, jedinjenja arsena i žive). 3) inhibitori enzima koji sadrže OH grupu u aktivnom centru (organofosforna jedinjenja, insekticidi). Ovi inhibitori inhibiraju, prije svega, aktivnost holinesteraze, enzima koji igra primarnu ulogu u aktivnosti nervnog sistema.
Reverzibilno inhibicija se može kvantificirati pomoću Michaelis-Menten jednačine. Reverzibilni inhibitori se dijele na konkurentne i nekonkurentne.
Kompetitivni inhibitori- To su supstance slične strukture kao podloga. Inhibitor se vezuje za aktivno mesto enzima i sprečava stvaranje kompleksa enzim-supstrat.
Klasičan primjer kompetitivne inhibicije je inhibicija sukcinat dehidrogenaze malonskom kiselinom. Sukcinat dehidrogenaza katalizira oksidaciju jantarne kiseline (sukcinata) dehidrogenacijom u fumarnu kiselinu.
Ako se malonska kiselina (inhibitor) doda mediju, tada će, kao rezultat njene strukturne sličnosti sa pravim sukcinatom supstrata, reagovati sa aktivnim mestom i formirati kompleks enzim-inhibitor, ali do reakcije neće doći.
Efekat inhibitora se eliminiše pomoću povećanje koncentracije supstrata. Uz kompetitivnu inhibiciju, kinetika enzimskih reakcija se mijenja: Km raste, V max ostaje konstantan(Sl. 3.5).
Rice. 3.5. Utjecaj kompetitivnih inhibitora na brzinu enzimske reakcije
Metoda kompetitivne inhibicije našla je primenu u medicinskoj praksi kao antimetaboliti.
Na primjer, sulfonamidni lijekovi se koriste za liječenje nekih zaraznih bolesti uzrokovanih bakterijama. Ovi lijekovi su strukturno slični para-aminobenzovoj kiselini koju bakterijska stanica koristi za sintezu folne kiseline koja je neophodna za život bakterija. Zbog ove strukturne sličnosti, sulfonamid blokira djelovanje enzima istiskivanjem para-aminobenzojeve kiseline iz kompleksa sa enzimom koji sintetizira folnu kiselinu.
Nekompetitivni inhibitori – tvari koje strukturno nisu slične supstratima. Nekonkurentni inhibitori se ne vezuju za aktivno mjesto, već za drugu lokaciju u molekuli enzima, na primjer, u alosteričnom centru. To mijenja konformaciju aktivnog centra na način da se poremeti interakcija supstrata s njim.
Za nekonkurentnu inhibiciju: V max se smanjuje, ali se K m ne mijenja(Sl. 3.6).
